北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

姬姆萨染色法- -鉴定巨噬细胞纯度的方法

小雪-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物网 小雪 0 39 2021-09-14
【摘要】分离小鼠肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage, AM),并鉴定其纯度和吞噬活性。方法采用肺泡灌洗法分离小鼠AM .分别通过瑞氏-姬姆萨染色法和Diff_Quik染色法鉴定AM的纯度;将FTC标记的大肠埃希菌与AM .按不同比例混合(10: 1.15: 1、20: 1)后孵育不同时间(20.25.30 min) ,荧光倒置显微镜下观察AM的吞噬活性。结果两种染色方法染色时,阳性细胞百分率均在94%以上, Dif-Quik染色法细胞阳性率略高于瑞氏-姬姆萨染色法,染色时间较瑞氏姬姆萨染色法短,且背景干净无杂质。小鼠AM的吞噬率和吞噬指数随着FITC标记的细菌与AM比例的增加而增大,且随孵有时间的延长呈先升高再降低的趋势。当细菌与细胞比例为20: 1.孵育时间为25 min时,,吞噬率和吞噬指数达最大,分别为(63. 67士4. 04)%和1.41 +0. 07。结论贴壁培养法可获得较高纯度的小鼠AM, Diff-Quik染色法鉴定巨噬细胞纯度优于瑞氏-姬姆萨染色法,其可代替瑞氏-姬姆萨染色法,成为- -种快速、高效的鉴定巨噬细胞纯度的方法。
  • 小鼠肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage ,AM )是由单核细胞迁移至肺组织中发育而成的,高表达吞噬性受体以及甘露糖受体,可吞噬和清除抗原",是肺部接触抗原最早、机会最多的细胞,构成机体抵御外来微生物侵人肺脏的第一-道防线[2],并可参与抗原提呈和免疫调节(3]。随着吸烟[4]、空气污染[5]等因素的不断恶化以及我国进人老龄化社会[6]等因索的影响,肺部疾病以及肺导致的其他器官疾病的发病率明显提高,肺部及AM的炎性变化已成为研究的热点。在研究中常需使用大量高纯度、高吞噬活性的AM ,因此其来源以及检测方法也越来越重要。

    有实验表明,在动物和人类的肺泡灌洗液中AM所占比例最大[9],可达80%,因此在研究肺部疾病时,为了获得大量AM,-般均采用肺泡灌洗法[ 01]。由于小鼠和大鼠单位重量肺组织AM分离量无显著差异[12],考虑到分离AM往往是实验的--小部分,为了节约成本,采用小鼠作为试验对象。在进行AM纯度鉴定时,需用到细胞涂片,获得一张染色后细胞数量较多的细胞涂片是纯度鉴定的关键。本实验曾尝试采用推片法、涂抹法[7),但由于从每只小鼠中分离的巨噬细胞数量有限,在染色过程中经水洗等步骤后大部分细胞脱落,致使涂片.上细胞数量较少,且染色效果不理想,细胞的核质区分不明显。

    经多次实验总结后,采用细胞爬片的方法,由于巨噬细胞有贴壁生长的特性,能在盖玻片伸展,细胞的核质分开,呈现梭形、椭圆形等形状,染色后能获得较满意的效果。AM作为肺部天然的免疫细胞以及肺部最早接触外来抗原的细胞,其吞噬功能往往是研究的热点。本实验采用FTTC标记的大肠埃希菌与AM共培养的方法检测AM的吞噬活性,相对于吞噬鸡红细胞的方法,该方法受人为等因素的影响较小,准确性较高,需特别注意的是在AM与FTTC标记的大肠埃希菌共培养后需进行洗涤,用PBS缓冲液洗涤2~ 3次,彻底洗去胞外未被吞噬的细菌。
     


     

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