北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

O-GSP对HEK293细胞线粒体损伤具有拮抗作用

小雪-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物网 小雪 0 33 2021-10-12
【摘要】探究低聚葡萄籽原花青素(oligomeric grape seed proanthocyanidins,O-GSP)对顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)导致的人胚肾细胞HEK293中线粒体损伤的保护作用及其作用机制。方法:通过试剂盒检测O-GSP、CDDP及O-GSP+CDDP处理后细胞中丙二醛( malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽〈glutathione,GSH)、活性氧(reaction oxygen species,ROS)含量、细胞质内糖代谢酶(己糖激酶和乳酸脱氢酶)活力和线粒体糖代谢酶(苹果酸脱氢酶)活力变化情况,并采用流式细胞术对各组细胞ATP含量、线粒体膜电位变化以及细胞凋亡率进行检测。结果:O-GSP预处理极显著改善了CDDP引起的细胞内MDA含量升高,还原型GSH、ROS、ATP含量及线粒体膜电位降低和糖代谢异常((P<0.01),从而减轻了CDDP诱发的线粒体损伤,对HEK293细胞凋亡有极显著的缓解作用(P<0.01)。结论:O-GSP对CDDP所致HEK293细胞线粒体损伤具有拮抗作用,并且该作用与O-GSP的抗氧化活性有关。
  • 顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)是临床上广泛应用的一种抗癌药物,在目前临床应用的联合化疗方案中,以CDDP为主药或有CDDP参与配伍的占70%~80%,并且CDDP在多种恶性肿瘤的治疗中都取得了显著疗效"-2。但CDDP在治疗过程中会对人体造成许多毒副作用,其中肾毒性最为严重351。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSP)是具有多种活性功能的一类多酚化合物的总称,具有保护心血管、免疫、抗炎、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒活性等生理功能6s8。由于结构中含有大量的酚羟基,GSP具有很强的抗氧化活性19-10]。其中生物活性最强的是低聚GSP( oligomeric-GSP,O-GSP) ""。GSP对肺癌、卵巢癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌等均有不同程度的抑制作用,可以诱导癌细胞凋亡2:O-GSP可增强CDDP对人肺癌细胞A549的杀伤作用。此外,O-GSP还具有强大的清除自由基、抗氧化、抗动脉粥样硬化等作用+-151。
    研究表明,氧化应激是CDDP诱发肾毒性的主要原因,而线粒体功能障碍是CDDP诱发肾毒性的中心环节116-18。前期研究表明,O-GSP对CDDP诱发的肾毒性具有拮抗作用,但其作用机制尚不明确"。此外,O-GSP对CDDP引起的肾脏细胞线粒体损伤是否具有保护作用及其作用机制还鲜见报道。因此,本研究用CDDP建造人胚肾细胞HEK293毒性模型,通过检测细胞内抗氧化指标、线粒体功能指标及细胞凋亡率,探究O-GSP对CDDP所致HEK293细胞线粒体损伤的保护作用及机制。

    1材料与方法

    1.1材料与试剂

    1.2 仪器与设备

    1.3 方法

    1.3.1 细胞培养

    1.3.2 细胞分组及处理

    1.3.3 HEK293细胞蛋白含量及MDA和还原型GSH含量测定

    细胞经1.3.2节方法处理后,消化并收集细胞,后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗两遍,离心弃上清液,再用PBS重悬。将装有细胞悬液的离心管置于冰水浴中,超声破碎:功率300 w,3~5 s/次,间隔30 s ,重复3~5 次;取破碎好的匀浆液﹐12 000 r/min离心10 min,收集上清液按照试剂盒说明书进行操作,测定细胞蛋白含量及MDA、还原型GSH含量。1.3.4细胞内ROS相对含量的检测
    将HEK293细胞按1×103个/mL接种至6孔板,并于37℃、5% CO,的培养箱中培养24 h。经1.3.2节方法处理后,去除培养液,加入1 mL含有10 mol/L2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐的新鲜培养基,在37℃细胞培养箱内孵育20 min,用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,再用胰酶消化制成单细胞悬液,在1000 r/min下离心5 min收集细胞。细胞用PBS重悬后,经200目网过滤去除杂质,收集于流式细胞仪专用管内,上机检测,结果显示为流式直方图。1.3.5细胞内HK、LDH和MDH活力的检测
    按照1.3.3节方法处理细胞,将细胞破碎并收集上清液,按照试剂盒说明书操作,检测细胞内HK、 LDH和MDH活力。

    1.3.6 细胞内ATP含量的检测

    先将细胞按照1.3.4节方法正常培养24 h,经不同药物处理后,吸除培养液,每孔加入50 uL裂解液进行裂解,之后4℃、12 000 r/min离心5 min,取上清液,按照试剂盒说明测定细胞内ATP含量。

    1.3.7 细胞内线粒体膜电位的检测
     

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