北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体

小雪-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物网 小雪 0 37 2021-10-12
【摘要】为构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体,试验根据质粒pBK760基因序列设计特异性引物,对质粒pBK760进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物连接到pMD20载体中,构建嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPUO1 ,提取重组质粒载体进行鉴定,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性转化子,最后将阳性转化子转入嗜水气单胞菌,获得具有标记抗性基因的嗜水气单胞菌。结果显示,构建的嗜水气单胞菌穿梭质粒载体pBKPUO1经PCR和酶切鉴定正确,并且能在大肠杆菌中表达,表明质粒pBK760成功插入pMD20载体中,嗜水气单胞菌穿梭质粒pBKPUO1构建成功。
  • pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体5。该载体以pUC19载体为基础,在其多克隆位点处的Xba I和l BamHI位点之间增加了Spe I,Nde I,EcoR V3种酶切位点,经EcoRV酶切后再在两侧的3'端添加“T”制备而成6。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'端添加一个“A”的特性,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率P。虽然质粒pBK760和l pMD20均可单独作为载体来使用,但是如果可以将其优点相结合,就可以发挥它们各自的优势,本实验就结合质粒pBK760和pMD20两方面的优点,利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体( pBKPUO1),便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 质粒和载体

    1.1.2 主要试剂

    1.2 引物设计与合成

    1.3 质粒pBK760的提取

    挑取嗜水气单胞菌单菌落,接种于5mL含50 ug/mL.卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养12h。菌液用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pBK760,-20 ℃储存待用。

    1.4质粒pBK760线性化

    以质粒pBK760为模板,通过设定引物(P1和 P2)进行PCR,使环状质粒pBK760线性化, PCR的具体反应条件如表1所示。反应程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 4.5 min , 32循环;72℃延伸 10 min; 4℃保存。PCR扩增后的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将检验正确的片段纯化回收。

    1.5 质粒pBK760和载体pMD20的连接

    将线性化质粒pBK760和载体pMD20进行连接,反应体系如表2所示。操作步骤如下:.16℃连接过役收210理uI菌物转化50 uLE .coli DH5α感受态细胞,取100 uL菌液涂布含有100 ug/mL.交1A5 mL含100 pp/mL氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃培养12 h,用质粒
    DNA小量抽提试剂盒提取质粒,获得穿梭质粒载体pBKPUO1。

    1.6 转化、酶切验证和分析

    制备嗜水气单胞菌感受态细胞,用电转化方法转化感受态细胞5,用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒,通过Hind Ⅲ和 EcoR Ⅰ进行双酶切验证。结果证明的确是质粒pBKPUO1 , 说明构建的穿梭载体pBKPUO1能够在嗜水气单胞菌中复制表达。确定重组质粒后进行测序分析(华大基因),序列分析结果和质粒pBK760序列相同,验证正确。

    2 结果

    2.1 PCR扩增结果

    以P1、P2为引物,以质粒pBK760为模板进行PCR扩增,凝胶电泳结果如图1所示,成功扩增出长度为3817 bp的质粒pBK760,与预期结果一致,可进行下一步实验。

    2.2 pBKPUO1单、双酶切鉴定

    对转化并提取的质粒pBKPUO1通过Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ进行单、双酶切验证,酶切后均得到6000 bp左右的片段,其他片段过小未能显示,与预期结果一致,凝胶电泳结果如图2所示。

    2.3 pBKPUO1图谱构建

    以DNAMAN为工具°,构建pBKPUO1图谱,图谱如图3所示。该穿梭质粒载体包括位于3355~3 561的启动子位点.位于3 726~3812的信号肽编码基因、位于1592~2363的卡那霉素抗性基因.位于2531~2 735的博来霉素抗性基因,位于347~676的lacZ.基因以及位于1833~2693的氨苄青霉素抗性基因。

    3 讨论

    嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体,是多种水生动物的原发性致病菌,为条件致病菌,是典型的人-兽-鱼共患病病原菌,嗜水气单胞菌的变异菌株较多,多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感,嗜水气单胞菌表现多种抗性,其中一个主要原因是含有多种质粒,本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒。

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