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细胞如何计数

李璐-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物
李璐 2020-06-03 14:41 评论( 0 ) 浏览( 1118 )

细胞计数在细胞培养工作中,常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活,确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别,冻存细胞复苏后的活力检测等。细胞悬液制备后,常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色,进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色(蓝色)。细胞计数一般用血细胞计数板,按白细胞计数方法进行计数,便于确定细胞的生活状况。所需物品 0.4%台盼蓝溶液 无水乙醇或95%乙醇溶液 脱脂棉 相差显微镜 试管、吸管、毛细吸管 细胞计数板细胞计数方法

1. 将动物细胞用PBS制备成适当浓度的细胞悬液备用。

2. 用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭计数板后,用绸布擦净,另擦净盖玻片一张,把盖片覆在计数板上面。

3. 用滴管吸取0.4%台盼蓝染液,按1∶1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入,使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡,否则要重做。稍候片刻,将计数板放在低倍镜下(10×10倍)观察计数。

4. 按图计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计数时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中,如果有细胞位于线上,一般计下线细胞不计上线细胞,计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过±5%。镜下观察,凡折光性强而不着色者为活细胞,染上蓝色者为死细胞。

5. 计完数后,需换算出每ml悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为0.01cm2,高为0.01cm,这样它的体积为0.0001 cm3,即0.1 mm3。由于1ml=1000 mm3,所以每一大方格内细胞数×10,000=细胞数/ml,故可按下式计算:细胞悬液细胞数/ml=4个大格细胞总数/4×10,0006. 如计数前已稀释,可再乘稀释倍数。

6. 计数细胞后,计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。 

注意事项1. 向计数板中滴细胞悬液时要干净利落,加量要适当,过多易使盖片漂移,或淹过盖片则失败,需重做;过少易出现气泡;不理想时,应重做;2. 镜下计数时,若方格中细胞分布明显不均,说明细胞悬液混合不均匀,需重新将细胞悬液进行混合,再重新计数。3. 计数时,对于位于边线或交界处的细胞/细胞团,遵循“计上不计下,计左不计右”的规则;4. 一个细胞团计做一个细胞。

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