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去内毒素质粒提取

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北纳波老师 2020-06-24 15:53 评论( 0 ) 浏览( 370 )

OMEGA小提试剂盒提取质粒

准备:

  • 检查SolutionⅠ是否加RNaseA

  • 检查DNA Wash Buffer是否加乙醇

  • N3 Buffer、ETR Solution、加RNaseA后的SolutionⅠ置于4℃保存

  • 冰浴、42℃水浴、70℃水浴

  • 柱子使用前加250ul GPS活化柱子

  • 可将Elution Buffer放入70℃水浴中,提高洗脱效率


1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含0.1% 100mg/ml 氨苄的LB培养基中。

2、室温下12000×g离心10min 。

3、弃去上清,剩余沉淀物中加入500ul 的SolutionⅠ/RNase A,彻底混匀。

4、将混悬液移至新的2ml 离心管中,加入500ul Solution Ⅱ,轻柔彻底混匀,可得清亮的细菌裂解物,室温下孵育2min (混匀时用力过大,可破碎出染色体DNA,使目的质粒纯度下降)。

5、向4 中液体加入250ul 预冷的N3 Buffer,轻柔、彻底混匀,直到出现白色絮状沉淀, 4℃ ≥12000×g 离心10min (可室温,最好4℃)( Buffer 应彻底混匀,若混合物粘稠呈棕色或呈球状,应多混匀几次以中和溶液,溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的)。

6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml 离心管1:0.1 的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min ,孵育过程中颠倒几次以混匀(加入ETR Solution 后,细菌裂解物将出现浑浊,但冰上孵育后将变澄清)(勿用2ml 离心管收集上清,因为2ml 离心管中有太多液体时, ETR Solution将悬浮于溶液中)。

7、将6 中液体于42℃孵育5min ,溶液将再次变浑。室温下12000×g 离心3min,ETR Solution将于离心管底部形成蓝色层。

8、将上层水相转移入新的2ml 离心管中, 按1:0.5 的比例加入无水乙醇(室温, 96~100%),轻柔混匀,室温下孵育1~2min 。

9、将8 中的溶液取700ul 到柱子中,组装收集管,室温下12000×g 离心1min ,弃去收集管中通过柱子的液体,柱子和收集管重复利用。

10、重复9中步骤,直到收集的细菌裂解物全部用完。

11、将500ul HBC Buffer加入柱子中,室温下12000× g 离心1min ,弃去收集管中废液(目的:将残存的蛋白污染物除去,是获得高质量DNA 所必需的)。

12、向柱子中加入混有乙醇的700ul DNA Wash Buffer ,室温下12000×g 离心1min,弃去收集管中液体。

13、重复12 中的步骤。

14、弃去收集管中液体,空管在最大转速(≥ 13000×g)离心3min 以干燥柱子(对于移除柱子中残留的乙醇是必须的)。

15、将柱子放入新的1.5ml 离心管中, 直接向柱子中的白色网状物上加入Endotoxin-Free Elution Buffer 80~100ul (依终产物浓度而定,可每次30ul×2 次),室温下放置2min ,≥13000×g 离心2min,洗脱DNA。

16、将15离心下来的洗脱液再次加入离心柱,重复15中的步骤。


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