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霉菌孢子悬液的制备和定量

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鲍菲 2020-07-03 11:01 评论( 0 ) 浏览( 385 )

霉菌是自然界中广泛分布的一种微生物,在湿度大、温度高的环境中极易生长。当霉菌在军用装备、漆膜、包装、电子设备等表面大量生长时,不仅会影响其外观,更会造成相关设备故障,影响设备的正常工作。因此,国内外一直很重视防止霉菌生长的各种研究工作。而霉菌试验则是检验相关产品和材料防霉能力的有效手段。世界各国也先后制定了相关的霉菌试验标准,标准中都涉及到相关霉菌的培养及霉菌孢子悬液的制作方法。


国内关于防霉实验的标准中,大多采用传统的PDA培养基进行霉菌的培养,活化及培养过程耗时较长,且产孢率低。同时孢子悬液的制备工艺繁琐复杂,孢子洗脱费时费力,效率难以提高。


此外,对于孢子悬液的保藏时间要求不超过14d,保存期相对较短。目前市面上出售的相关孢子悬液产品,存在保藏时间短、活力易减低、性能不可控、贮存运输不便等问题,给实际生产带来了极大的不便。

霉菌孢子制品的制备方法,包括以下步骤:


S1:将霉菌接种至含有小米和麸皮的固体培养基上;


S2:待所述固体培养基表面长满所述霉菌后,用洗脱溶液从所述固体培养基上洗脱所述霉菌的孢子,得到孢子洗脱液;


S3:将所述孢子洗脱液进行过滤,离心洗涤,得到孢子沉淀物,然后将所述孢子沉淀物加工成所述霉菌孢子制品。


用麸皮+小米作为培养基,来代替传统的PDA固体培养基进行霉菌的培养,不仅产孢量有了大幅度的提高,而且缩短了孢子成熟时间,极大的提高了工作效率。传统的PDA固体培养基进行霉菌培养后,需要人工将培养基表面的孢子刮至无菌水中,这一过程耗时费力,大大降低了工作效率。而用麸皮+小米(1:1)作为培养基进行霉菌培养后,只需向其中加入无菌水就可直接进行下一步的震荡过滤工作,工作效率得到了很大的提高。


在一个优选实施方案中,S1中所述固体培养基通过以下方法配制得到:将50重量份的小米、50重量份的麸皮、2重量份的葡萄糖以及80重量份的蒸馏水混匀,高温灭菌15min。


在一个优选实施方案中,S1中,所述霉菌放置于三角瓶中28℃下培养。三角瓶培养方式,操作简便,易洗脱。


在一个实施方案中,S2中,所述洗脱溶液含有0.01%吐温80的水溶液。选择吐温80浓度为0.01%的无菌水溶液作为霉菌孢子悬液的洗脱液,更有利于孢子洗脱与计数。


在一个实施方案中,S2包括以下步骤:用所述洗脱溶液浸渍所述固体培养基上的霉菌,180-220r/min震荡30min,收集处理后的洗脱溶液,即得到所述孢子洗脱液。


在一个优选实施方案中,S1中,所述霉菌放置于三角瓶中28℃下培养。三角瓶培养方式,操作简便,S3中,所述过滤通过用8层纱布(21s*21s/30*28)来进行。纱布过滤操作方便,易回收利用,且适合孢子悬液的大批量生产。


在一个优选实施方案中,S3中,所述离心洗涤时的离心转速为5000-8500rpm,洗涤次数为3-5次。离心速度为5000-8500rpm之间时,离心效果比较好,但是当再提高离心速度,当离心速度为12000rpm时,离心效果反而下降。


在一个实施方案中,所述孢子制品为孢子悬液,通过将所述孢子沉淀物重悬至无菌水中,调节孢子浓度为106-107cfu/mL来得到。


在一个优选实施方案中,所述孢子制品为孢子粉,通过将所述孢子沉淀物干燥得到。孢子粉产品相对于传统的孢子悬液产品,其保存期有了极大的延长,传统孢子悬液要求保存期不超过14d,本孢子粉产品其保存期可至少延长至180d,复溶后孢子悬液浓度基本没有变化。以孢子粉的产品形式进行贮存运输,更加便利,可有效的避免保存运输时孢子悬液的洒漏等。


在一个优选实施方案中,所述孢子沉淀物在35℃、-0.09MPa条件下减压干燥。35℃下干燥大幅减少了干燥时间,但是对孢子的活力影响不大。

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