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荧光定量数据有效性分析

莫晨阳-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物
莫晨阳 2020-07-16 09:05 评论( 0 ) 浏览( 270 )

判断数据的有效性,可以结合扩增曲线,溶解曲线,标准曲线以及NTC(检验引物)和NRC(检验模板)来分析。

1.扩增曲线应呈现出平滑的S型曲线,起始无扩增,起峰时间正常,由扩增曲线得到的Ct值是判断实验成功与否的重要参考,Ct值有一定的可信范围,临床检验小于33,科学研究小于38,内参基因一般小于20,且样品间内参的Ct值差不超过1,表明内参基因表达量稳定,复孔Ct值标准偏差不超过0.5;

2.溶解曲线应呈现单峰,峰的宽度较小,NTC和NRC无特异的峰出现;

3.标准曲线的斜率范围-3.58~-3.10,对应引物的扩增效率范围90%~110%,R2代表线性拟合度,一般大于0.95;

4.NTC用于判断反应是否存在模板污染,引物是否特异,是否会形成引物二聚体。NTC最佳状况是没有扩增,即扩增曲线和溶5.解曲线与基线重合,没有Ct值。NTC有扩增的情况下,至少与加入模板体系的Ct值相差5或10以上;

6.NRC用于判断cDNA模板中是否存在基因组DNA残留,可以间接反映RNA中基因组DNA污染情况,理想情况下,NRC没有Ct值,有Ct值的话至少要跟加入cDNA模板体系的Ct值相差5或10以上。


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