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DNA二代测序--Roche 454测序系统

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翟江 2020-08-24 15:47 评论( 0 ) 浏览( 140 )

Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理如下:

(1)DNA文库制备

454测序系统是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段,并在片段两端加上不同的接头,或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增,连接载体,构建单链DNA文库。

(2)Emulsion PCR (乳液PCR)

454DNA扩增过程和illumina截然不同,它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上,并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”(水包油),基本过程是在PCR反应前,将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面,水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列,因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂,保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增,并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成后,可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增,每个小片段都将被扩增约100万倍,从而达到下一步测序所要求的DNA量。

(3)焦磷酸测序

测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠,接着将磁珠放在一种PTP平板上。测序方法采用焦磷酸测序法,将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中,启动测序反应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板,每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对,则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光,同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录,最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。反应结束后,游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP,从而导致荧光淬灭,以便使测序反应进入下一个循环。由于454测序技术中,每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行,因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。

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