北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

探讨绿薄荷精油对温和气单胞菌的抑制效果(二)

发布时间:2021-09-13 16:26 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 抑菌效果及QSIs活性

图 1 绿薄荷精油对紫色杆菌CV026产紫色素的抑制活性
紫色杆菌|北纳生物

通过观察实验菌株的生长情况,发现绿薄荷精油剂量为2、4、6、8、10 μL/mL时,对菌株CV026的最小抑菌剂量为4 μL/mL。随后对温和气单胞菌进行抑菌实验,发现在相同剂量范围内,绿薄荷精油对温和气单胞菌并无抑菌作用。因此选取亚抑菌剂量(4 μL/mL以下剂量)的绿薄荷精油进行QSIs检测实验,并设置实验剂量为0.5、1.0、1.5 μL/mL和2.0 μL/mL。图1表示在亚抑菌剂量下,绿薄荷精油对紫色杆菌CV026 QS活性的影响。从图中可以看出添加绿薄荷精油的孔径周围出现白色、浑浊、不透明的抑制圈,表明绿薄荷精油具有抑制菌株CV026产生特征性紫色素的能力。

2.2 紫色菌素定量分析

通过酶标法测定菌株CV026紫色菌素产量,其相对下降量可反映绿薄荷精油对菌株CV026 QS现象的抑制程度。随着绿薄荷精油剂量的升高,菌株CV026紫色菌素产量呈剂量依赖性下降。与未添加精油相比,当绿薄荷精油剂量为2.0 μL/mL时,菌株CV026紫色菌素产量的下降率达56.17%。同时,研究不同剂量下绿薄荷精油对菌株CV026生长的影响,结果表明,绿薄荷精油并未对菌株CV026菌液密度造成影响,进而说明其并未抑制菌株CV026的生长代谢,而是通过干扰菌株CV026的QS系统,使其紫色菌素的产生受到了抑制。

2.3 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜形成的影响

2.3.1 酶标板法测定生物被膜

生物被膜指微生物为适应生存环境而附着于生物或非生物物质接触表面,利用多糖基质将自身包裹而形成的一种聚集体膜样物。生物被膜广泛存在于由金属、塑料、玻璃等各类材料制成的食品机械设备表面,难以彻底清除,且极易导致食品微生物污染,从而造成严重的食品安全问题和经济损失。Aswathanarayan等研究表明,微生物生物被膜的形成受QS系统调控。因此,本研究通过干扰QS系统为靶点来控制生物被膜的形成。以空白组为基准(生物被膜相对生成率100%),添加C6-HSL信号分子的阳性对照组生物被膜相对生成率明显增高,进一步说明温和气单胞菌生物被膜生成受QS系统的调控。此外,随着绿薄荷精油剂量的增大,该菌株生物被膜生成率随之减小,而菌液密度未受影响。这说明,绿薄荷精油可通过干扰、抑制QS系统来调控温和气单胞菌生物被膜的生成,且未对菌株有致死或抑制作用。

2.3.2 光学显微镜及扫描电子显微镜观察生物被膜

图 2 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜影响的光学显微镜图
光学显微镜图|北纳生物

由图2a、b可见,经染色的菌体紧密相连形成大片的紫色膜状物,且添加C6-HSL信号分子的阳性对照组,还出现局部菌体聚集成具有层次感的深紫色团状物;对比绿薄荷精油处理组(图2c~f),经结晶紫染色后,随着添加剂量的升高,菌体难以在载体上牢固附着、易被冲散,未见菌体聚集形成大片紫色膜状物,仅有少量菌体相连且膜状物分布稀疏。

利用扫描电子显微镜可清晰直观地观察生物被膜微观结构的变化。

图 3 绿薄荷精油对温和气单胞菌生物被膜影响的扫描电子显微镜图
扫描电子显微镜图|北纳生物

如图3a、b所示,菌体被胞外聚合物层层包裹形成复杂的三维立体网络结构,并覆盖整个载体表面,单一菌体难以显现。添加C6-HSL信号分子的阳性对照组,生物被膜形态更为致密。

图3c~f为绿薄荷精油处理组,随着绿薄荷精油剂量的升高,网络结构退化并逐渐解体,胞外聚合物明显减少且仅有少量菌体被包裹其中。据此,推测绿薄荷精油可通过抑制胞外聚合物形成,来减弱温和气单胞菌的成膜能力。

2.4 绿薄荷精油对温和气单胞菌胞外蛋白酶活力的影响

温和气单胞菌是鱼类等水产品中常见的腐败菌,具有分泌蛋白水解酶的能力。其致腐机理是利用蛋白酶水解水产品中蛋白质及游离氨基酸,促进自身生长繁殖,从而加速腐败进程,导致水产品风味和品质劣变,甚至产生有毒有害物质。葛静慧等发现降解海参优势腐败菌消化嗜冷杆菌(Psychro-bacter alimentarius)的AHLs可阻断其蛋白酶的产生。赵丽珺等研究发现冷却猪肉中常见的产蛋白酶的腐败菌(假单胞菌和沙雷氏菌)均受AHLs介导的QS系统调控。

2.5 绿薄荷精油对温和气单胞菌群集和泳动的影响

群集和泳动是细菌在接触表面迁移的两种方式,群集运动特指发生在大于0.45%的琼脂上的表面迁移,而泳动则指发生在小于0.45%的琼脂培养基上的迁移。细菌的运动性被证实在定植到宿主表面及后继形成生物被膜的过程中发挥着关键作用。Merritt等认为耶尔森鼠疫杆菌的泳动和群集运动受通过QS系统调控的生物表面活性剂的影响。Daniels等还发现QS系统可通过调节群集细胞的分化、鞭毛基因的合成及细菌表面活性物质的产生而参与到不同种类细菌的群集运动。

添加C6-HSL信号分子的阳性对照组较空白组菌株的运动性明显增强。绿薄荷精油的添加与温和气单胞菌群集和泳动运动特性呈负相关,且有一定的剂量依赖性。这与Merritt和Daniels等的研究结果相一致,且与2.3节中绿薄荷精油对生物被膜的抑制作用呈现一致性。

2.6 GC-MS定量分析绿薄荷精油对温和气单胞菌产AHLs的影响

表 1 GC-MS检测绿薄荷精油对温和气单胞菌分泌AHLs的影响
温和气单胞菌|北纳生物
注:—.未检测到该类信号分子。

由表1可以看出,0~12 h,温和气单胞菌分泌AHLs主要是C8-HSL和C12-HSL,24~48 h为C4-HSL和C8-HSL;在整个实验周期内,C8-HSL的分泌量一直较高。在菌株生长初期(0~12 h)菌株分泌的信号分子不仅种类少且质量浓度很低;随着菌株的生长(12 h以后),信号分子的种类逐渐增加,质量浓度也急剧上升,同时长链的信号分子C12-HSL不再出现,其原因可能是随着菌株的生长和培养基内的营养物质不断消耗,pH值升高导致菌株生长环境发生改变,从而导致长链的信号分子内酯环断裂。与空白组对比,经绿薄荷精油处理的实验组信号分子的种类未发生变化,但其质量浓度明显下降,说明绿薄荷精油能够抑制温和气单胞菌QS信号分子的分泌。

3 结 论

本研究利用紫色杆菌CV026作为QS现象检测对象,验证了绿薄荷精油在亚抑菌剂量下对细菌QS系统的抑制作用。结果表明,绿薄荷精油具有降低菌株CV026产紫色菌素的能力,其剂量为2 μL/mL时,对紫色菌素的抑制率达56.17%;温和气单胞菌某些与腐败相关的生物特性(生物被膜、胞外蛋白酶活力、泳动和群集运动)均受到QS系统的调控,添加一定剂量的绿薄荷精油能够达到抑制这些生物特性表达的目的,且随着剂量的增加,其抑制效果更趋明显。

此外,GC-MS检测结果表明,绿薄荷精油能够有效抑制温和气单胞菌分泌AHLs。因此,绿薄荷精油具有良好的QS抑制活性,可作为新型的QS抑制剂用于水产品防腐保鲜。但是,目前绿薄荷精油对QS系统信号分子分泌、受体蛋白的结合以及相关调控基因表达的抑制机理还未明晰,需要进一步研究。

相关链接:紫色杆菌,精油,产紫色素,抑菌剂,生物被膜,菌株嗜冷杆菌北纳生物

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