北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

探究牛至精油对腐生葡萄球菌抑制作用机制(一)

发布时间:2021-09-14 16:24 作者:北纳生物编辑-陈丹

近年来,关于牛至精油在水产品保鲜中的应用研究也逐见报道。如杜云飞等将牛至精油作为抗菌剂,分别加入至乙烯-乙烯醇共聚物和聚乙烯,通过挤出流延制备成2 种食品保鲜膜,发现使用添加过牛至精油的保鲜膜包装黑鱼片,其脂质氧化速率降低,微生物生长受抑制。郑宗林等将牛至精油添加至红罗非鱼饲料中,经过20 周的养殖发现,添加牛至精油饲料能使冷藏鱼片中肠杆菌和大肠菌群数显著降低,且货架期较对照组延长2 d;van Haute等也报道牛至精油处理可使三文鱼的冷藏货架期显著延长,且能明显抑制大肠杆菌与乳酸菌生长。

水产品在流通期间,其鲜度与品质极易下降,微生物是导致其腐败变质的主因。现有研究发现,在腐败过程中,只有极少种类的特定腐败菌参与这一过程并产生不可接受异味。这些适合生存、繁殖并产生腐败臭味代谢产物的菌群则为该产品的特定腐败菌。因此,如何延缓水产品品质劣变、延长其贮藏货架期、抑制由于微生物繁殖而引起的腐败变质,现已成为科研工作者普遍关注的热点。腐生葡萄球菌(Saprophytic staphylococcus)作为水产品的特定腐败菌,为葡萄球菌属非致病性革兰氏阳性菌。

牛至精油的广谱抑菌性与不易产生耐药性的特点,使其在食品工业领域具有很好的开发利用前景,而其对菌体作用机制的研究更会为牛至精油的后期应用提供依据。其中,王倩等研究了银杏叶提取液对腐生葡萄球菌的作用机制,结果表明腐生葡萄球菌经银杏叶提取液处理6 h后,菌体变形且胞间黏结,其主要通过对菌体细胞膜和细胞壁的破坏实现其抑菌效果。本实验采用琼脂平板打孔法通过抑菌圈直径确定牛至精油对腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),由微生物生长曲线、电导率、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、紫外物质吸收与扫描电子显微镜观察来综合评价牛至精油对腐生葡萄球菌的抑制作用机制,以期为牛至精油作为生物保鲜剂应用于水产品保鲜领域提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

腐生葡萄球菌(Saprophytic staphylococcus)为课题组前期从腐败鲳鱼中分离、筛选并鉴定后保存的菌株。

牛至精油(产地:摩洛哥;提取部位:植株;生产工艺:蒸馏法;主要成分为香芹酚(39.45%)、对伞花烃(21.05%)、百里香酚(14.55%))购于上海雅琪实业有限公司,使用前置于阴凉干燥处存放。

AKP测试盒、LDH测试盒 南京建成生物工程研究所;胰蛋白胨大豆肉汤(tryptic soy broth,TSB)培养基、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar,TSA)培养基、氯化钠、无水乙醇、戊二醛(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Centrifuge 5810R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司;BCD-256KF型冰箱 青岛海尔股份有限公司;ZQZY-70B型振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;LS-3750型灭菌锅 日本SANYO公司;Synergy2型自动酶标仪 美国BioTek公司;DDB-11A型电导率仪杭州齐威仪器有限公司; Mira 3型扫描电子显微镜捷克Tescan公司;M334712型全自动微生长曲线分析仪芬兰Bioscreen公司;UV-2450型紫外-可见分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将牛至精油以体积分数25%乙醇溶液为溶剂混合配制成不同体积分数备用。腐生葡萄球菌菌种在TSB液体培养基中活化2~3 代后,吸取100 μL菌液涂布在TSA固体培养基中,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,重复平板划线。挑取活化后的腐生葡萄球菌单菌落在TSB培养基中37 ℃培养8 h,用灭菌生理盐水将其配制成含菌数106~107 CFU/mL菌悬液备用。

1.3.2 MIC的测定

MIC的测定参考Dutra等的方法,并稍作修改。采用打孔法测定抑菌圈直径,从而得到牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC。吸取100 μL对数期菌悬液均匀的涂布于TSA固体培养基表面,并在平板中央进行打孔,采用二倍稀释法分别吸取8%(体积分数,下同)、4%、2%、1%、0.5%、0.25%牛至精油100 μL加入孔内;用不添加牛至精油菌液作为空白组,以25%乙醇溶液为对照组。将各组置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径。每个实验做3 个平行,按抑菌直径大小划分相对敏感度。参考苏萌萌等的方法测定牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC(其中MIC值为明显抑制腐生葡萄球菌生长的最低体积分数)。

1.3.3 微生物生长曲线的测定

采用Diao Mingming等的方法,并稍作修改。取对数期菌液,按1%接种量分别加入MIC与2 MIC牛至精油至无菌TSB培养基中,置于37 ℃、150 r/min摇床培养24 h,由全自动微生物生长曲线分析仪每隔1 h自动取样测定OD600 nm值,以不添加牛至精油的菌液作为空白组,以添加25%乙醇溶液的培养液为对照;以培养时间为横坐标,OD600 nm为纵坐标,绘制腐生葡萄球菌在不同条件下的微生物生长曲线。

1.3.4 电导率的测定

参考Yan Feilong等的方法,并稍作修改,分别将MIC与2 MIC的牛至精油添加至1%接种量的TSB实验菌液中,置于摇床37 ℃、150 r/min培养。分别于0、2、4、6、8、10、12 h取培养液测定其电导率,以此来确定菌体金属离子的泄漏情况。以不添加精油的培养液作为空白组,以添加25%乙醇溶液作为对照组。每组样品设3 个平行。

1.3.5 AKP活力的测定

腐生葡萄球菌按1%接种量在含有MIC与2 MIC牛至精油的TSB培养液中接种,置于摇床37 ℃、150 r/min培养12 h,分别于0、2、4、6、8、10、12 h取样2 mL,置于离心机中4 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液,按AKP测试盒说明书的方法测定胞外AKP活力。以不添加精油组作为空白,添加25%乙醇溶液作为对照组,每组实验设3 个平行。

1.3.6 牛至精油对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响

1.3.6.1 紫外吸收物质的泄漏情况测定

参考Chen等的方法测定牛至精油对腐生葡萄球菌紫外吸收物质的影响。将牛至精油分别加入待测菌株培养液中,使其终浓度为MIC与2 MIC,再将其置于37 ℃、150 r/min摇床中振荡培养,分别于0、2、4、6、8、10 h取样,再4 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液通过紫外分光光度计测定菌体上清液在260 nm波长处的吸光度,每组实验设3 个平行。

1.3.6.2 LDH活力的测定

LDH在细胞质中存在并参与细胞的糖酵解途径,在细胞膜受损时会泄漏至胞外。将牛至精油分别加入待测菌株培养液中,使其终浓度为MIC与2 MIC。置于摇床37 ℃、150 r/min振荡培养,分别于0、6 h取样,4 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液并按照LDH测试盒的方法进行测定。以未经精油处理的菌株培养液为空白,25%乙醇溶液替代等体积的精油作为对照组,每组实验设3 个平行。

1.3.7 菌体微观结构的测定

参考Xu Jianguo等的方法测定牛至精油处理后菌体的微观结构。取对数期菌种按1%接种量接种于含MIC、2 MIC牛至精油TSB溶液中培养,以不添加牛至精油的TSB培养液作为空白组,于摇床37 ℃、150 r/min培养6 h后,取一定量的菌液于4 000 r/min、4 ℃离心10 min,弃去上清液,菌体用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤3 次,并用体积分数2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱中固定4 h,将样品分别用不同体积分数(30%、50%、70%、90%、100%)乙醇梯度脱水后,置于-80 ℃冰箱冷冻保存4~8 h,冷冻干燥机干燥24 h后涂至金属箔片并固定喷金,置于扫描电子显微镜下观察菌体形态结构。

1.4 数据处理与分析

由SPSS 13.0软件进行平均值与方差分析,实验数据均采用平均值±标准差表示,用Origin 8.5软件绘制曲线。

相关链接:肠杆菌,牛至精油,乙烯-乙烯醇聚乙烯,抗菌剂,乳酸菌葡萄球菌属,北纳生物

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