北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

探究牛至精油对腐生葡萄球菌抑制作用机制(二)

发布时间:2021-09-14 16:26 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC

表1 牛至精油对腐生葡萄球菌的抑菌效果
牛至精油对腐生葡萄球菌的抑菌效果|北纳生物

注:++++.极敏感(抑菌圈直径≥20 mm);+++.高敏感(15 mm≤抑菌圈直径<20 mm);++.中敏感(10 mm≤抑菌圈直径<15 mm);+.低敏感(7.8 mm<抑菌圈直径<10 mm);-.无效(抑菌圈直径≤7.8 mm)。

由表1可知,随着牛至精油体积分数的增加,其对腐生葡萄球菌作用效果也愈明显。当牛至精油的体积分数为8%时,表现为极敏感;牛至精油的体积分数为0.25%时,表现为低敏感;而25%乙醇溶液对腐生葡萄球菌无抑制作用,表明25%乙醇溶液对牛至精油的抑菌效果不产生影响。低敏感时牛至精油的最小体积分数为0.25%,因此,牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC为0.25%。

2.2 牛至精油对腐生葡萄球菌生长的影响

牛至精油处理对腐生葡萄球菌生长曲线的影响|北纳生物
图1 牛至精油处理对腐生葡萄球菌生长曲线的影响

由图1可以看出,空白组与对照组菌株保持S型曲线正常生长,培养2 h后进入对数期,在10 h后进入稳定期,可见25%乙醇溶液对腐生葡萄球菌的生长无抑制作用。而经MIC牛至精油处理后,腐生葡萄球菌进入对数期生长时间延至4 h;2 MIC牛至精油处理后,菌体进入对数期延至10 h,说明牛至精油处理可延缓腐生葡萄球菌进入对数期,达到其抑菌目的。Park等研究发现,月桂酸处理能抑制金黄色葡萄球菌进入对数期;蓝蔚青等究复合保鲜剂对金黄色葡萄球菌的抑菌效果时也得到类似结论。

2.3 牛至精油对腐生葡萄球菌培养液电导率的影响

细胞膜对菌体的正常生长具有保护作用,当菌体在受到抑菌物质的伤害或在不良环境下生长时,细胞膜渗透性会有所改变,且电解质会渗漏到细胞外,导致细菌培养液电导率增加。经过牛至精油处理的菌液的电导率显著高于空白和对照组,且牛至精油的体积分数与电导率呈正相关。由此可知,牛至精油对腐生葡萄球菌的作用呈剂量依赖性,这与生长曲线的结果一致,可能由于菌体经牛至精油处理后,其细胞膜的通透性有所增加,使菌体内电解质如K+、Ca2+泄漏至胞外,这与李婷等的研究结果相似。

2.4 牛至精油处理对腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影响

细胞壁可有效防止外来物质如抗生素、抑菌剂等进入细胞内,AKP存在于细胞膜与细胞壁间,对生物体内物质代谢起着重要作用,因此其活力是反映细胞壁完整度的重要指标之一。当菌体正常生长时,AKP活力无法在胞外检出,反之亦然。因此,可通过检测细胞外AKP的活力来判断菌体细胞壁的完整性与通透性

腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影响|北纳生物
图2 牛至精油处理对腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影响

如图2所示,牛至精油处理后腐生葡萄球菌胞外的AKP活力明显上升,且在2 h后对照组的AKP活力稳定,而处理组样品的AKP活力显著高于对照组。在经牛至精油处理4 h后,MIC与2 MIC牛至精油处理组的AKP活力分别为0.85 U/L与1.09 U/L,这同电导率、生长曲线的测定结果相一致,进一步反映牛至精油可使菌体的细胞壁完整性遭到破坏。Hu Wei等研究发现山苍子精油对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的细胞壁也起到破坏作用,可使菌液AKP活力显著提升。

2.5 牛至精油对腐生葡萄球菌细胞膜通透性的影响

2.5.1 紫外吸收物质的泄漏情况

细菌细胞膜的功能包括渗透屏障、物质转运、能量代谢,其正常的结构与功能是细菌正常生长的基本前提。菌体内的核酸与蛋白质类物质在260 nm波长处有强吸收峰,通过培养液中此类物质在260 nm波长处吸收峰的强弱可判定菌体细胞膜的通透性。

随着处理时间的延长,处理组培养液在260 nm波长处的吸光度逐渐上升,且2 MIC牛至精油处理组的吸光度显著高于MIC处理组,表明牛至精油体积分数越高,其对细胞膜的破坏越严重;而未经牛至精油处理的空白组与25%乙醇溶液处理组的吸光度无明显变化。可能由于腐生葡萄球菌经精油处理后,其菌体的细胞膜完整性被破坏,核酸、蛋白质等大分子由于菌体细胞膜通透性的增加而渗透到胞外。张赟彬等[30]研究肉桂精油对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的作用机制时也发现,随着精油浓度的升高,菌体内核酸与蛋白质类物质的泄漏增加;Wang Yue等研究肉桂皮精油对牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果时也得到相似结论。

2.5.2 胞外LDH活力

LDH参与细胞的糖酵解途径,其存在于细胞质中,当细胞膜受到损伤时会泄漏至胞外。当腐生葡萄球菌经过精油处理6 h后,MIC、2 MIC处理组培养液中的LDH活力分别从0 h的2.91、3.67 U/g升至6 h的17.59、18.67 U/g。而空白和对照组明显低于牛至精油处理组,反映出牛至精油对菌体细胞膜的损伤作用,其能使菌体内核酸等生物大分子外泄,营养物质丧失,从而达到抑菌与杀菌的目的,本结果与紫外吸收结果一致。

2.6 微观结构观察结果

腐生葡萄球菌|北纳生物
图3 腐生葡萄球菌经牛至精油处理6 h后扫描电子显微镜图

由图3可知,空白组的腐生葡萄球菌外观光滑、平整饱满。而经牛至精油处理后,菌体外观形态变粗糙,有凹痕存在,尤其在菌体两端较为明显;经过MIC牛至精油处理后,菌体出现胞膜破裂、凹陷现象,部分菌体畸形,细胞壁膜褶皱,有裂纹,甚至剥落;而经2 MIC牛至精油处理后,菌体大量胞膜剥落,且破裂畸形,细胞受损严重。说明牛至精油对菌体结构的破坏程度与其体积分数呈正相关,可能由于牛至精油是一类脂溶性物质,其通过结合细胞膜在膜内形成孔道进入细胞内,同时与胞内活性物质相互作用,而对菌体细胞结构造成破坏,导致其死亡。Silva等发现茶树精油对单增李斯特菌的细胞形态也产生类似损害;Dutra等得出牛至精油能对脂环酸芽孢杆菌造成破坏而达到抑菌目的;Bhargava等发现牛至精油能对大肠杆菌与鼠伤寒杆菌的细胞结构造成破坏,使其细胞膜破裂而达到抑菌目的。

3 结 论

绿色、健康、纯天然的食品添加剂已成为当今时代的主流,而牛至精油作为一种植物天然提取物,因其良好的抗氧化性、独特风味与较强抑菌性逐渐成为新型食品防腐剂的首选对象。本研究得出牛至精油对腐生葡萄球菌的MIC为0.25%,且经牛至精油处理后的菌体细胞内容物大量外泄至胞外,说明牛至精油会使菌体细胞壁、细胞膜的通透性与完整性遭到破坏,由于牛至精油的脂溶性特点,也使其更好地与菌体细胞膜表面结合,能在胞膜内形成孔道,使其中的疏水性活性物质与菌体内的活性物质相互结合,影响细胞的正常代谢,从而抑制其生长;牛至精油对菌体结构的破坏程度与其体积分数呈正相关。牛至精油对菌体遗传物质影响与菌体蛋白质组学表达仍需深入研究。本研究为牛至精油作为食品工业新型抑菌剂提供了理论参考。

相关链接:腐生葡萄球菌,抑制,精油,乙醇溶液,菌株,甲氧西林金黄色葡萄球菌北纳生物

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