北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

金黄色葡萄球菌新型肠毒素的纯化及溶液构象分析(一)

发布时间:2021-09-18 16:25 作者:北纳生物编辑-陈丹

金黄色葡萄球菌K型肠毒素(S. aureus enterotoxin K,SEK)编码基因sek最早于2001年通过对S. aureus基因组序列比对分析而发现。Jarraud等[13]研究表明,sek基因与编码肠毒素SEG、SEI、SEL和SEM的基因形成一个操纵子位于肠毒素基因簇。流行病学调查显示,sek不但是临床分离的致病性金葡菌菌株中最高频出现基因之一,更是与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistant S. aureus,MRSA)的mecA基因具有显著相关的肠毒素编码基因,这暗示含有sek基因的金黄色葡萄球菌在逃避宿主免疫系统攻击和抗生素抗性获得上可能发挥重要功能。

尽管关于SEK催吐活性、超抗原活性、时序表达、高灵敏度检测以及单抗中和治疗策略等方面被广泛研究,但迄今为止,关于SEK蛋白溶液构象的报道并不多见。众所周知,蛋白质生物学功能发挥依赖于天然蛋白形成正确的折叠态构象,因此,蛋白构象及其稳定性分析对于蛋白功能研究至关重要。鉴于SEK肠毒素引起食物中毒的普遍性和高发性,为进一步理解肠毒素SEK结构与功能关系,本研究通过优化SEK原核表达体系获得重组蛋白,进而利用荧光发射谱、圆二色谱以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)对SEK溶液构象进行研究,旨在揭示维持SEK溶液构象稳定性的分子基础,为探索破坏SEK结构稳定性,建立更加高效合理的食品消毒工艺奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒

金黄色葡萄球菌SA005(该菌株携带enterotoxin K-like protein(selk)基因,其NCBI登录号为KU574280.1)保存于本实验室;感受态大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 天根生化科技(北京)有限公司;原核表达质粒pET-28a(+) 美国Novagen公司。

1.1.2 试剂

聚合酶链式反应(polymerase chain raction,PCR)扩增试剂、核酸分子质量标准、限制性内切酶EcoRI、SalI 宝生物工程(大连)公司;蛋白Marker 天根生化科技(北京)有限公司;SDS-PAGE 5×上样缓冲液康为世纪生物科技有限公司;牛血清白蛋白、胰蛋白胨、酵母粉 英国Oxoid公司;卡那霉素、氯霉素、异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG) 美国Sigma公司;thrombin 北京博奥拓达科技有限公司;丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、咪唑、三羟甲基氨基甲烷(trismetyl aminomethane,Tris) 美国Amresco公司;Ni2+-NTA-Sepharose、DEAE Sepharose Fast Flow 美国GE Healthcare公司;10 kDa超滤管 德国Millipore公司。

含SDS和巯基乙醇SDS-PAGE上样缓冲液:10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、0.5 mL β-巯基乙醇、1 mL 1%溴酚蓝、0.9 mL蒸馏水;含SDS不含巯基乙醇SDS-PAGE上样缓冲液:10 mL含0.6 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、5 mL 50%甘油、2 mL 10% SDS、1 mL 1%溴酚蓝、1.4 mL 蒸馏水;Buffer A:500 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris(pH 8.0);Buffer B:1 mmol/L pH 7.0磷酸缓冲液;thrombin储液:1 000 U溶于1 mL磷酸缓冲液,储液浓度1 U/μL;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HZQ-F160全温振荡培养箱 苏州培英实验设备有限公司;5804R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司;WD800B型微波炉 格兰仕集团有限公司;TSNENEN031445 PCR仪、DYY-6C型核酸电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra Cell电泳仪 美国Bio-Rad公司;JY92-IIN型超声破碎仪 宁波新芝生物技术有限公司;Chirascan plus圆二色谱仪 英国Applied Photophysics Limited公司;F-7000荧光光谱仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 ΔNspSEK蛋白原核表达载体的构建

引物以及ΔNspSEK(ΔN表示N端缺失,sp为信号肽signal peptide的缩写)蛋白原核表达载体构建参考文献,金黄色葡萄球菌基因组DNA采用本实验室建立的微波加热法提取,利用不含信号肽的sek基因上游引物序列:5’-CGTACGGAATTCCAAGGTGATATAGGA ATTG-3’(下划线为EcoRI酶切位点),下游引物序列:5’-CGCTAGGTCGACTTATATCGTTTCTTTATAAG-3’(下划线为SalI酶切位点,加粗体为插入的终止密码子)进行PCR扩增。扩增所得片段经琼脂糖凝胶电泳检测及PCR产物纯化试剂盒纯化后,与质粒载体pMD18-T进行T-A连接,分别将插入ΔNspsek基因的pMD18-T质粒与空载质粒pET-28a(+)用EcoRI/SalI双酶切,将上述双酶切获得的基因片段用T4 DNA连接酶连接,使得目的基因定向克隆至表达载体。将插入ΔNspsek基因的质粒命名为pET-28a(+)-ΔNspsek,转化至大肠杆菌DH5α扩增,将提取到的质粒pET-28a(+)-ΔNspsek进行EcoRI/SalI双酶切鉴定。同时将提取到的质粒送成都擎科生物技术有限公司测序。

1.3.2 重组质粒在大肠杆菌中表达条件优化

将经过测序验证的重组质粒pET-28a(+)-ΔNspsek分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS和Rosetta(DE3)筛选高表达宿主菌株,在相应的抗生素抗性平板上(卡那霉素抗性质量浓度30 µg/mL;氯霉素抗性质量浓度34 µg/mL)随机挑取6 个含有重组质粒的单克隆菌落,分别过夜培养后,按1∶50的比例扩大至含相应抗生素抗性的LB培养基中,37 ℃振荡培养3 h,然后加入适当浓度诱导剂IPTG后,继续恒温振荡培养一定时间后,离心收集菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达。

选择高表达菌株,分别进行诱导时间梯度(37 ℃,0.5 mmol/L IPTG分别诱导0、1、2、4、6、8、10、12、24 h),诱导IPTG浓度梯度(37 ℃,8 h,IPTG浓度梯度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mmol/L),诱导温度梯度(8 h,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导温度分别为17、27、37 ℃),以及Zn2+浓度梯度(0、1、5、10、15、20、25 mmol/L)进行优化,确定最佳诱导条件。

用获得的最佳条件进行小量诱导,12 000 r/min、10 min离心收集菌体,缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH 8.0)洗涤菌体2~3 次,重悬菌体进行超声破碎,超声破碎条件:功率30%,模式1,变幅杆Φ06,超声破碎3 s,停3 s,共5 min。随后12 000 r/min,离心10 min,收集上清液,沉淀以相同步骤再处理2 次,合并上清液为蛋白粗提液,蛋白粗提液与沉淀分别进行SDS-PAGE检测,目的蛋白大部分存在于上清液,表明蛋白为可溶性表达;目的蛋白大部分存在于沉淀则为包涵体表达。

1.3.3 His-ΔNspSEK蛋白分离与纯化

根据1.3.2节确定的最优表达菌株为出发菌种接种于5 mL LB液体培养基中,37 ℃过夜振荡培养。次日将种子液转接到500 mL LB中按照确定的最佳表达条件扩大培养,监测菌液吸光度A600 nm至0.6~0.7时,进行IPTG诱导表达。离心收集菌体,菌体经PBS洗涤后重悬浮于20 mL Buffer A缓冲液中,冰浴超声破碎,超声破碎条件:功率285 W,振幅30%,模式1,变幅杆Φ06,超声破碎3 s,停3 s,共15 min,离心收集上清液。将得到的His-ΔNspSEK蛋白粗提液上样于事先用含Buffer A缓冲液平衡好镍离子亲合层析柱。先以Buffer A缓冲液和含50 mmol/L咪唑的Buffer A缓冲液除去大部分杂蛋白,再以含100 mmol/L咪唑的Buffer A洗脱目的蛋白,SDS-PAGE分析纯度。

1.3.4 ΔNspSEK重组蛋白聚合态和热稳定分析

将纯化的ΔNspSEK蛋白分别加入2 种不同的SDSPAGE上样缓冲液(一种是含SDS和不含巯基乙醇;另一种是同时含SDS和巯基乙醇)处理后进行SDS-PAGE分析,纯化的ΔNspSEK蛋白置于100 ℃水浴0、3、6、10、20、40、60 min,牛血清白蛋白作对照,SDS-PAGE分析蛋白的受热降解程度。

1.3.5 圆二色谱测定和荧光光谱分析

将纯化的ΔNspSEK重组蛋白用Buffer B调节质量浓度为0.1 mg/mL,参考文献条件,在Chriascan plus型圆二色谱仪上进行蛋白溶液的测定,仪器参数设定为:扫描范围190~260 nm,激发光和发射光狭缝1 nm,中速扫描,光谱校正开启,25 ℃氮气吹扫下进行。每个样品扫描3 次取平均值。参考文献条件将纯化的ΔNspSEK蛋白调节质量浓度为45 μg/mL,干式恒温器25 ℃温育10 min,后用F-7000荧光光谱仪进行测定,仪器参数设定:激发波长278 nm和295 nm,发射波谱扫描范围为300~400 nm,扫描速率为1 200 nm/min,扫描激发光和发射光狭缝为5 nm,PMT电压700 V,消除光栅,每个样品扫描3 次取平均值。

1.4 数据分析和图像处理

使用圆二色谱数据在线分析软件DichroWeb对扫描的圆二色谱数据进行分析,选择CDSSTR拟合方案,采用圆二色谱参考数据集SMP180,190~240 nm波长范围内对扫描数据进行拟合,计算溶液中ΔNspSEK蛋白二级结构含量。将得到荧光光谱数据用FL Solutions转化成Excel表格,然后用Origin7.5作出278 nm和295 nm波长处荧光光谱图。

相关链接:金黄色葡萄球菌,肠毒素,蛋白,甲氧西林菌株丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺北纳生物

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