北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

金黄色葡萄球菌新型肠毒素的纯化及溶液构象分析(二)

发布时间:2021-09-18 16:27 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒pET-28a(+)-ΔNspsek的基因测序鉴定结果

将重组表达质粒的插入基因ΔNspsek进行测序,得到长度为729 bp的片段,利用NCBI BLAST多序列比对发现克隆到的ΔNspsek基因序列与菌株SA005的selk基因序列(登录号:KU574280.1)的第70~729位碱基序列100%吻合,第1~69位为信号肽序列。质粒双酶切鉴定结果见图1,表明SEK融合蛋白(His-ΔNspSEK)表达载体构建成功。

图1 重组质粒pET-28a()-ΔNspsek的双酶切鉴定
双酶切鉴定|北纳生物

1~4.重组质粒pET-28a(+)-ΔNspsek的阳性克隆子经EcoRI/SalI双酶切产物;5.空白;M1. DNA Marker DL 2 000;M2. DNA Marker DL 10 000。

2.2 pET-28a(+)-ΔNspsek在大肠杆菌中表达条件优化及可溶性表达验证结果

将重组原核表达质粒pET-28a(+)-ΔNspsek分别转化至BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)3 种不同的感受态细胞,对每个转化子在平板上随机挑选6 个单克隆,经过相同的条件进行小量诱导表达。目标蛋白在3 种不同的宿主菌中均有明显表达,且Rosetta(DE3)表达宿主菌中蛋白产量普遍较高,该菌株整合了大肠杆菌缺乏的6 种稀有密码子对应的tRNA,因此,选取表达量最高的Rosetta(DE3)菌株中的1号单克隆作为后续表达条件优化实验的菌株,进一步探讨融合蛋白的最佳表达条件。

当IPTG浓度梯度升高至0.6 mmol/L时,目标蛋白表达量最大,随着IPTG浓度升高,杂蛋白也在增加,为减轻纯化负担,本研究选择0.5 mmol/L为最佳IPTG浓度。由图2E可知,随着诱导时间的延长,目标蛋白表达量也在逐渐增加,但8 h后增加不明显,因此,选择最佳诱导时间为8 h。低温诱导目标蛋白表达量较大,因此,设置最佳诱导温度为27 ℃。低浓度Zn2+并未显著改善目标蛋白表达量,而当Zn2+浓度高于10 mmol/L时,目的蛋白几乎不表达,因此,Zn2+浓度选择为0 mmol/L。综上所述,选择IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间8 h、诱导温度27 ℃、不添加Zn2+为最佳诱导条件。

利用上述最优表达条件对Rosetta(DE3)宿主菌1号单克隆进行小量诱导表达验证,3 次平行实验均获得ΔNspSEK蛋白高产量表达。随后,将1 mL菌液离心收集菌体,经Buffer A缓冲液重悬后超声破碎,裂解液离心所得上清液的泳道1,离心的沉淀的泳道2,上清液中有清晰的蛋白表达条带,结果表明融合蛋白为可溶性表达。

2.3 最优条件下的His-ΔNspSEK表达纯化及凝血酶切除6×His标签结果

按上述最优条件扩大培养所得融合蛋白超声破碎粗提液进行镍亲合层析纯化,经过含10、50 mmol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱杂蛋白后,含His标签的ΔNspSEK融合蛋白被100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱效果好,见图2A的第5泳道。进一步采用凝血酶切除6×His标签肽,图2B的泳道3效果较好,对于300 μg融合蛋白底物,凝血酶量为1.0 IU时,酶切4 h即可完全除去标签肽。进一步将凝血酶切除标签肽后的反应体系超滤去除标签肽并更换为Buffer B,收集过DEAE离子交换树脂的穿透液进行SDS-PAGE,结果如图2C中的泳道2所示,结果表明除去His标签肽的ΔNspSEK蛋白纯度高,可以满足后续光谱学测定。

图2 His-ΔNspSEK蛋白的纯化与凝血酶切除6×His标签肽
凝血酶切除6×His标签肽|北纳生物

A. His-ΔNspSEK蛋白的纯化;1.平衡液洗脱杂蛋白;2.含10 mmol/L咪唑平衡液洗脱杂蛋白;3~4.含50 mmol/L咪唑平衡液洗脱杂蛋白;5.含100 mmol/L咪唑平衡液洗脱目标蛋白。B.凝血酶切除6×His标签肽;1.酶切前对照;2~4.凝血酶用量分别为0.5、1.0 、1.5 IU/300 μg(以SEK计)。C. DEAE阴离子交换树脂层析除去凝血酶;1.穿透前;2.穿透液。

2.4 纯化的ΔNspSEK聚合状态分析和热稳定分析

将凝血酶切除标签后经DEAE纯化的ΔNspSEK蛋白分成2 份,分别用含有SDS与β-巯基乙醇的样品处理液(泳道1)和只含有SDS不含β-巯基乙醇的样品处理液(泳道2)处理后,进行SDS-PAGE,结果如图3A所示,由于SDS可以破坏蛋白质亚基间的非共价相互作用,β-巯基乙醇可破坏链内或链间二硫键,因此,泳道1显示的是ΔNspSEK蛋白单体形式。泳道2中样品由于缺乏β-巯基乙醇,不能破坏链间二硫键,部分ΔNspSEK蛋白以二聚体形式呈现。结果表明,在非还原态时,截除信号肽的SEK可能通过链间二硫键形成二聚体的形式存在。进一步将去除His标签肽的ΔNspSEK重组蛋白100 ℃热处理,间隔时间为0、3、6、10、20、40、60 min进行采样,分别对样品进行SDS-PAGE分析,如图3B所示,100 ℃加热到40 min时,重组蛋白ΔNspSEK依旧无明显降解,但到加热60 min时可以看出蛋白出现部分降解,说明ΔNspSEK蛋白具有较高的热稳定性。

图3 ΔNspSEK蛋白聚合状态分析(A)和热稳定性分析(B)
 ΔNspSEK蛋白聚合状态分析|北纳生物

D. ΔNspSEK蛋白的二聚体;M. ΔNspSEK蛋白的单体。BSA.牛血清白蛋白。

2.5 纯化ΔNspSEK蛋白的圆二色谱和荧光发射谱分析

纯化的重组蛋白ΔNspSEK远紫外区的圆二色谱见图4A,表现为192 nm波长处的强正峰和208 nm波长处的强负峰信号。采用DichroWeb在线分析软件,计算溶液中ΔNspSEK重组蛋白二级结构含量为α-螺旋29.1%、β-折叠23.6%、β-转角28%和无规卷曲19.4%,Difference(exp-recon)表明实验数据与拟合数据之间的误差在可接受范围之内。由图4B可知,蛋白溶液分别在278 nm和295 nm波长激发时,具有相同的344 nm波长色氨酸荧光发射峰。与处于亲水环境的游离色氨酸354 nm波长荧光发射峰相比蓝移了10 nm,说明虽然ΔNspSEK蛋白中色氨酸处于蛋白质分子表面,但仍未完全暴露于极性水环境中。

室温荧光发射|北纳生物

图4 ΔNspSEK重组蛋白的远紫外圆二色谱(A)与室温荧光发射谱(B)

3 讨 论

本研究对SEK蛋白表达条件进行优化,并建立表达ΔNspSEK蛋白的方法。在纯化蛋白前通过查找文献得知ΔNspSEK理论等电点为7.7。而采用凝血酶酶切后杂蛋白的等电点为5.0~5.5,据此,本研究尝试使用阴离子交换方法进行蛋白质酶切纯化。通过多次实验证明当缓冲液pH值为7.0时,穿透后,凝血酶结合到了DEAE柱上,ΔNspSEK蛋白大部分保留在穿透液中,这样的尝试大大降低了酶切后的纯化难度,此方法可供相关研究者借鉴。

众所周知,加热对于食品加工与安全具有重要作用,是食品杀菌的主要手段。本研究对金黄色葡萄球菌肠毒素重组蛋白ΔNspSEK的热稳定进行研究,通过圆二色谱分析揭示ΔNspSEK蛋白溶液构象β-折叠为23.6%。刘骥等研究认为新型肠毒素M的蛋白溶液构象β-折叠高达42%,王小红研究表明传统B型肠毒素β-折叠达40.4%,经过121 ℃处理30 min后,仍具有39.9%的β-折叠含量。β-折叠对肠毒素热稳定性维持具有关键作用,SEK的β-折叠含量比SEM和SEB的都低,因此,可以解释SEK的热稳定性不如SEM和SEB好,当100 ℃加热到60 min时,蛋白出现部分降解。如果在食品加工中延长加热时间可以破坏部分SEK肠毒素,但是还会有部分SEK稳定存在,需进一步探索破坏SEK的方法。

对融合蛋白ΔNspSEK的荧光发射谱进行分析,发现278 nm波长激发时呈现的是色氨酸特征性的344 nm波长荧光发射主峰。该峰位与295 nm波长单独激发色氨酸残基时,产生的荧光发射峰一致,根据蛋白质分子内能量转移有效性和色氨酸荧光峰位相对于极性水环境(354 nm波长发射峰)的显著蓝移,可以推测纯化的ΔNspSEK处于构象紧密的天然折叠状态。

本研究成功构建SEK的融合蛋白ΔNspSEK可溶性原核表达系统,纯化的融合蛋白ΔNspSEK在溶液中处于构象紧密的天然折叠状态,ΔNspSEK蛋白热稳定性好,为进一步研究SEK的结构与功能关系提供参考依据。

相关链接:宿主菌,蛋白,凝血酶,咪唑平衡液,β-巯基乙醇色氨酸北纳生物

本文章来源于网路,如有版权问题,请与本网联系
 


 

点赞图片

登录后才可以评论

立即登录
推荐阅读
请告知您的电话号码,我们将立即回电

通话对您免费,请放心接听

温馨提示:

1.手机直接输入,座机前请加区号 如13164239859,010-58103778

2.我们将根据您提供的电话号码,立即回电,请注意接听

3.因为您是被叫方,通话对您免费,请放心接听

关闭
大抽奖
请设置您的密码:
分享到微信