北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

酒酒球菌耐酸突变株苹果酸发酵能力分析(二)

发布时间:2021-09-23 16:25 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 单因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.1 pH值对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.1.1 pH值对菌株生长能力的影响

同pH值条件下的生长曲线|北纳生物
图1 菌株SX-1b(a)、耐酸突变株b1(b)和商业菌株31-DH(c)在不同pH值条件下的生长曲线

由图1可知,菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着pH值降低而降低,当pH值为3.0时,b1的生长量高于SX-1b和31-DH。在不同pH值条件下菌株的生长曲线可为之后L-苹果酸降解速率的测定提供时间依据。结果表明,pH值对菌株的生长具有抑制作用。但菌株b1在低pH值(3.0)下具有较强的生长能力。Tourdot-Maréchal等研究发现,当pH值为3.2时,酒酒球菌的生长受到严重抑制。葡萄酒的pH值一般为3.0~3.4,酒酒球菌能否在葡萄酒的高酸环境中生长繁殖对苹果酸-乳酸发酵的启动具有重要意义。经过研究发现,低pH值将会引起酒酒球菌细胞膜结构和成分的变化,使菌株的生长受到抑制,但陈其玲等采用离子注入诱变,分离纯化后获得的菌株b1表现出良好的抗酸胁迫能力,这有可能是离子注入诱变使与细胞膜结构有关的基因发生突变。

2.1.1.2 pH值对菌株L-苹果酸降解速率的影响

pH值对L-苹果酸降解速率的影响|北纳生物
图2 pH值对L-苹果酸降解速率的影响

将菌株接种于不同培养基培养120 h,测定L-苹果酸含量。当菌株的培养时间相同时,菌株的L-苹果酸降解量越高则其L-苹果酸降解速率越高。因此,以菌株在120 h时苹果酸的降解量表示L-苹果酸降解速率。由图2可知,菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着pH值降低而降低,即低pH值对菌株L-苹果酸降解速率具有抑制作用。当pH值为3.0时,b1保持较高的苹果酸降解量,为1.978 6 g/L,是SX-1b的1.34 倍,是31-DH的1.18 倍。

苹果酸乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中的关键酶,因此,其活性将会影响菌株L-苹果酸降解速率。研究发现,对于发酵速率较快的菌株,其苹果酸乳酸酶基因(mleA)的转录水平较高。经过离子注入诱变,SX-1b的mleA可能发生突变,从而影响苹果酸乳酸酶活性和mleA的表达。

2.1.1.3 pH值对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

pH值对β-葡萄糖苷酶活性的影响|北纳生物
图3 pH值对β-葡萄糖苷酶活性的影响

以p-NPG为底物,在37 ℃条件下反应1 h,测定菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性。由图3可知,在不同pH值条件下,菌株SX-1b、b1和31-DH均具有β-葡萄糖苷酶活性,且β-葡萄糖苷酶活性具有菌株差异性,这与之前的研究结果基本一致。菌株β-葡萄糖苷酶活性随着pH值降低而降低。当pH 3.0时,SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性受到强抑制作用,但b1受到的抑制作用较小,β-葡萄糖苷酶活性为8.610 0 μmol/(g·min),是SX-1b的6.64 倍,是31-DH的1.62 倍,这与陈其玲等的研究基本一致。当pH 3.8时,SX-1b保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。

大部分酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的最适pH值为5.0,当pH值降到3.5时,β-葡萄糖苷酶活性急剧降低,且Michlmayr等研究发现,在葡萄酒pH值(3.0~4.0)条件下,短乳杆菌β-葡萄糖苷酶活性很低,由此可知低pH值对菌株的β-葡萄糖苷酶具有抑制作用。与杨芮等研究结果相比较,菌株b1在低pH值条件下保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。

2.1.2 乙醇体积分数对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.2.1 乙醇体积分数对菌株生长能力的影响

不同乙醇体积分数下的生长曲线|北纳生物
图4 菌株SX-1b(a)、耐酸突变株b1(b)和商业菌株31-DH(c)在不同乙醇体积分数下的生长曲线

由图4可知,菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着乙醇体积分数增加而降低,即乙醇对各菌株的生长均具有强抑制作用。当乙醇体积分数为14%时,在稳定期生长量最高的为菌株b1。

2.1.2.2 乙醇体积分数对菌株L-苹果酸降解速率的影响

菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着乙醇体积分数增加而降低,即乙醇对菌株L-苹果酸降解速率具有抑制作用。但b1的L-苹果酸降解量均高于其余菌株。当乙醇体积分数为14% 时,菌株b1的L-苹果酸降解量为1.717 7 g/L,分别是SX-1b和31-DH的1.36 倍和1.05 倍。

Miller等研究发现,乙醇对植物乳杆菌mleA的表达具有抑制作用。Wang等研究发现,当乙醇体积分数大于4% 时,随着乙醇体积分数的增加,酒酒球菌SD-2a的苹果酸乳酸酶活性显著降低。经过离子注入诱变,SX-1b的mleA发生突变,可能提高了菌株mleA的表达和苹果酸乳酸酶的活性。

2.1.2.3 乙醇体积分数对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性随着乙醇体积分数增加显著降低,这与之前的研究结果一致。葡萄酒的乙醇体积分数一般为12%~14%,在该条件下,菌株b1保持较高的β-葡萄糖苷酶活性。当乙醇体积分数为14%时,β-葡萄糖苷酶活性最高的为菌株b1(1.597 5 μmol/(g·min)),分别是SX-1b和31-DH的1.09 倍和1.07 倍。

2.1.3 L-苹果酸对菌株抗胁迫能力的影响

2.1.3.1 L-苹果酸对菌株生长能力的影响

菌株SX-1b、b1和31-DH在稳定期的生长量随着L-苹果酸质量浓度增加而降低。当L-苹果酸质量浓度为3 g/L时,菌株b1在稳定期的生长量高于SX-1b和31-DH。

2.1.3.2 L-苹果酸对菌株L-苹果酸降解速率的影响

菌株SX-1b、b1和31-DH的L-苹果酸降解量随着L-苹果酸质量浓度增加而增加,即L-苹果酸对菌株的L-苹果酸降解速率具有促进作用。葡萄酒中L-苹果酸质量浓度一般为3 g/L,在此质量浓度下,L-苹果酸降解量最高的为菌株b1(2.846 9 g/L),分别是SX-1b和31-DH的1.19 倍和1.12 倍。

2.1.3.3 L-苹果酸对菌株β-葡萄糖苷酶活性的影响

菌株SX-1b、b1和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性随着L-苹果酸质量浓度增加而降低。L-苹果酸对SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用较强,对b1的β-葡萄糖苷酶活性抑制作用较小。当L-苹果酸质量浓度小于3 g/L时,菌株SX-1b和31-DH的β-葡萄糖苷酶活性较高,当L-苹果酸质量浓度大于3 g/L时,菌株b1表现出较高的β-葡萄糖苷酶活性。当L-苹果酸质量浓度为3 g/L时,菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株,为6.823 8 μmol/(g·min),分别是SX-1b和31-DH的1.16 倍和1.06 倍。

2.2 复合因素胁迫环境对菌株抗胁迫能力的影响

表1 ΔOD600 nm正交试验方差分析结果
ΔOD600 nm正交试验方差分析结果|北纳生物
注:*.差异显著(P<0.05)。下同。

由表1可知,ΔOD600 nm与单因素胁迫试验结果相差较大。pH值、乙醇体积分数和L-苹果酸对菌株的生长均具有抑制作用,因此,在3个胁迫因素协同作用下,对菌株生长的抑制作用将会显著增强。影响菌株生长因素的主次顺序均为pH值>乙醇体积分数>L-苹果酸质量浓度。由K值可以确定最优组合为A3B1C3,即pH 3.8、乙醇体积分数10%、L-苹果酸质量浓度4 g/L。

SPSS 20.0统计软件对试验结果进行方差分析,对于菌株b1,因素A和B有显著性差异(P<0.05)。对于菌株31-DH,因素A有显著性差异(P<0.05)。

3 结 论

本研究通过对耐酸突变菌株b1生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的研究发现,b1表现出良好抗胁迫能力和苹果酸-乳酸发酵能力,具有成为商业发酵剂的潜能。结果表明低pH值、高乙醇体积分数对菌株的生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均具有抑制作用,L-苹果酸对其生长能力和β-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用,对L-苹果酸降解速率具有促进作用。当单因素胁迫环境分别为pH 3.0、乙醇体积分数14%和L-苹果酸质量浓度3 g/L时,b1的L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性均高于其余菌株。

正交试验进一步确定各因素对菌株生长能力、L-苹果酸降解速率和β-葡萄糖苷酶活性的影响程度为:pH值>乙醇体积分数>L-苹果酸。当模拟酒的乙醇体积分数为14% 时,菌株b1的累积L-苹果酸降解量为1.493 2 g/L,分别是SX-1b与31-DH的1.41 倍和1.26 倍,且菌株b1的β-葡萄糖苷酶活性高于其余菌株。在后续的研究中,可将菌株b1接种于葡萄酒中进行苹果酸-乳酸发酵,进一步探究其L-苹果酸降解能力及其对葡萄酒香气的影响。

相关链接:酒酒球菌,葡萄酒,L-苹果酸,降解,乳酸酶菌株β-葡萄糖苷酶北纳生物

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