北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造(二)

发布时间:2021-10-12 16:23 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 α-L-岩藻糖苷酶突变文库的高通量筛选

通过调整PCR体系中Mg2+或者Mn2+浓度获得具有合适突变率的文库是常规手段。采用不同浓度的Mg2+(3、5 mmol/L)和Mn2+(0.1、0.2、0.4 mmol/L)对α-L岩藻糖苷酶基因(PbFuc29A1)进行易错PCR扩增,每组突变库随机挑选12株菌落测序计算突变率,发现采用5 mmol/L Mg2+和0.2 mmol/L Mn2+构建文库的突变率为0.295%,在合理突变率范围内。初筛得到524 个突变体可检测到α-L-岩藻糖苷酶活力,水解物经TLC分析,发现有129 个突变体具有转糖苷活性。进一步筛选出6 株转糖苷产物能够明显被α-L-岩藻糖苷酶FgFCO1水解的突变体。最终得到1 个转糖苷产物中2’-FL含量明显升高的正向突变体酶,命名为mPbFuc29A1。

2.2 mPbFuc29A1的表达及纯化

经过Ni-IDA亲和层析柱一步纯化,得到mPbFuc29A1的电泳级纯酶(图2),该酶的纯化倍数为3.41,回收率为 47.7 % 。十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)显示该酶的分子质量约为50 kDa,与野生型PbFuc29A1分子质量一致。

α-L-岩藻糖苷酶突变体|北纳生物

图 2 α-L-岩藻糖苷酶突变体mPbFuc29A1纯化SDS-PAGE图

2.3 mPbFuc29A1的酶学性质

mP bFuc29A1的最适p H值为5.0,与PbFuc29A1一致。mPbFuc29A1在pH 6.0~9.0范围内于30 ℃保温8 h可保持80%以上的酶活力。mPbFuc29A1在pH 5.0的稳定性较差,在pH 5.0保温2 h,残余酶活力降至50%;在pH 11.0保温3 h,mPbFuc29A1完全失活,而未突变酶PbFuc29A1在pH 11.0保温3 h的残余酶活力仍为30%左右。因此,突变后α-L-岩藻糖苷酶的pH值稳定性有所下降。mPbFuc29A1的最适温度为40 ℃,在30 ℃和35 ℃保温8 h、在40 ℃保温4 h可保持80%以上的酶活力,在40 ℃保温8 h可保持60%以上的酶活力,在45 ℃保温0.5 h可保持75%左右的酶活力,超过0.5 h酶活力迅速下降。而未突变酶PbFuc29A1在30、35 ℃和40 ℃保温8 h可保持80%以上的酶活力,在45 ℃保温2 h可保持60%左右的酶活力。因此,突变后的α-L-岩藻糖苷酶的温度稳定性也有所下降。

2.4 mPbFuc29A1的底物特异性和动力学常数

表 1 α-L-岩藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1动力学参数

 α-L-岩藻糖苷酶|北纳生物

如表1所示,mPbFuc29A1对pNP-FUC的Vmax值为25.1 μmol/(min·mg),较PbFuc29A1略有降低,Km值为0.39 mmol/L,小于PbFuc29A1的Km值(0.72 mmol/L)。2.5 2’-FL和3’-FL的合成对mPbFuc29A1合成3’-FL和2’-FL的条件进行优化,结果表明,温度、pH值、加酶量、反应时间和乳糖浓度对3’-FL和2’-FL的合成均有显著影响。其中,pH值对2’-FL合成的影响较为明显,当pH值由5.5升高至8.0140 mPbFuc29A1合成2’-FL浓度逐渐升高,而3’-FL浓度逐渐降低;当pH值超过8.5时,3’-FL和2’-FL的转化率均迅速下降。最终得到的mPbFuc29A1转糖苷合成2’-FL相对最适条件为反应温度35 ℃、反应pH 8.0、加酶量0.75 U/mL、反应时间4.0 h和乳糖浓度0.7 mol/L,相对最适条件下2’-FL的转化率为23.6%,比野生型酶提高了9.1%,3’-FL的转化率为56.4%,2’-FL和3’-FL的总转化率为80%。

2.6 mPbFuc29A1序列分析、定点突变和结构模拟

测序结果表明, α - L - 岩藻糖苷酶突变基因(mPbFuc29A1)中有2 个碱基发生改变,导致该突变体中2 个氨基酸发生改变,即Asp21Val和Glu266Lys,将PbFuc29A1和mPbFuc29A1的氨基酸序列与其他GH29家族α-L-岩藻糖苷酶进行序列比对,发现Asp21和Glu266均为部分保守氨基酸。定点突变酶的转糖苷产物分析结果表明(表2),与野生型α-L-岩藻糖苷酶PbFuc29A1相比,突变体Asp21Val的转糖苷产物比例没有明显变化,而突变体Glu266Lys的转糖苷产物中3’-FL的比例明显降低,2’-FL的比明显升高,推测第266位谷氨酸(Glu)突变是造成PbFuc29A1转糖苷产物比例发生改变的关键因素。与突变体Glu266Lys相比,双突变体Glu266Lys/Asp21Val的转糖苷产物中2’-FL的比例有进一步提升。

表 2 地杆菌α-L-岩藻糖苷酶PbFuc29A1及其突变酶转糖苷产物分析

地杆菌α-L-岩藻糖苷酶|北纳生物

注:转糖苷产物比例为2’-FL和3’-FL占转糖苷产物总量的百分比。

采用SWISS-MODEL对PbFuc29A1和mPbFuc29A1进行结构预测,结果如图5所示。PbFuc29A1的单体结构由2 个结构域组成。N端结构域具有类似于(β/α)8-TIM桶的折叠,主要由6 个β-片层和10 个α-螺旋结构组成,其中催化残基位于TIM桶内部。C端结构域则包括6 个反向平行的β-片层和1 个小的α-螺旋结构。在PbFuc29A1中,位于loop区第266位的谷氨酸(Glu)与第268位的赖氨酸(Lys)、第316位的丝氨酸(Ser)和第370位的丝氨酸(Ser)存在氢键相互作用,该位点在mPbFuc29A1中突变为赖氨酸(Lys266),与周围的氨基酸氢键作用减弱(图5B)。而第21位氨基酸在突变前后,与周围氨基酸的氢键作用力无明显变化。此外,通过预测PbFuc29A1和mPbFuc29A1的表面电荷分布,发现进化后的mPbFuc29A1催化凹槽左侧区域的电性由弱负电变为强正,这主要是由Glu266Lys突变引起;而在催化凹槽背面的电性由强负变为中性,这主要是由Asp21Val突变引起。


3 讨 论

目前关于提高α-L-岩藻糖苷酶的转糖苷活性及区域选择性的研究多采用理性或半理性设计的方法,定向进化技术应用较少。本研究利用易错PCR对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶PbFuc29A1进行随机突变,从约10 000 个突变株中获得了一个合成2’-FL能力显著提高的突变酶mPbFuc29A1。mPbFuc29A1的最适pH值为5.0,明显低于一些细菌来源的α-L-岩藻糖苷酶,如解硫胺素芽孢杆菌(Paenibacillus thiaminolyticus,pH 7.0~9.0)、产碱杆菌(Alcaligenes sp. pH 7.0、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)BL23(pH 7.0)和福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythia,pH 7.0)等。但与大部分真菌来源的α-L-岩藻糖苷酶接近,如黑曲霉(Aspergillus niger,pH 5.0)、禾谷镰刀菌(pH 4.6)和层出镰刀菌(Fusarium proliferatum,pH 5.5)等。mPbFuc29A1的最适温度为40 ℃,比PbFuc29A1提高了5 ℃,与大部分细菌和真菌来源的α-L-岩藻糖苷酶都接近,但明显低于海栖热袍菌(60 ℃)和产碱杆菌(50 ℃)来源的α-L-岩藻糖苷酶。值得注意的是,与PbFuc29A1相比,mPbFuc29A1的底物特异性发生显著变化,对pNP-FUC和3’-FL的比活力显著降低,但是对2’-FL的比活力升高到3 倍左右。

一般来说,α-L-岩藻糖苷酶的底物特异性与其转糖苷产物组成相关。因此,mPbFuc29A1底物特异性的变化可能会导致其转糖苷产物的变化。此外,mPbFuc29A1的Km值(0.39 mmol/L)小于PbFuc29A1(0.77 mmol/L),表明突变酶对pNP-FUC的亲和力增强,但该酶对pNP-FUC的比活力却没有升高。目前,已有一些具有转糖苷活性的α-L-岩藻糖苷酶被用于2’-FL的合成。本研究中,mPbFuc29A1合成2’-FL的转化率最高为23.6%,与PbFuc29A1比较提高了9.1%,高于芽孢杆菌(13%)和禾谷镰刀菌(14%)来源α-L-岩藻糖苷酶,与α-L-岩藻糖苷酶突变体FgFCO1-D286H相当(23%),于海栖热袍菌α-L-岩藻糖苷酶(32.5%)。mPbFuc29A1合成3’-FL的转化率为56.4%,合成2’-FL和3’-FL的总转化率为80%,’-FL的合成中具有潜在应用价值。

4 结 论

利用定向进化技术成功将地杆菌α-L-岩藻糖苷酶(PbFuc29A1)进行改造,使其合成2’-FL的转化率从14.5%提高到23.6%。mPbFuc29A1水解2’-FL的比活力提高到3 倍左右,但是对pNP-FUC和3’-FL的比活力明显降低。mPbFuc29A1中有2 个氨基酸发生替换,分别是Asp21Val和Glu266Lys,其中位于loop区的Glu266Lys是导致mPbFuc29A1c底物特异性和转糖苷产物发生改变的关键。mPbFuc29A1在合成2’-FL中具有潜在的工业应用价值。

相关链接:层出镰刀菌黑曲霉α-L-岩藻糖苷酶,菌株,十二烷基硫酸钠北纳生物

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