北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

检测单核细胞增生李斯特氏菌的新型滚环扩增方法(一)

发布时间:2021-10-13 16:24 作者:北纳生物编辑-陈丹

传统检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法过程繁琐、检验时间长,对于一些菌含量较少的样品不易检出,容易出现假阴性结果。免疫学的检测方法比较繁琐,而且抗体的获取需要专业的技术人员进行操作。随着分子生物学和基因组学的不断发展,各种分子生物学检测方法逐渐建立起来,主要是以变温核酸扩增技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时PCR(real-time PCR)为代表的定性和定量检测方法,需要较昂贵的温度循环控制设备PCR仪和特别昂贵的real-time PCR仪,限制了其在基层检测机构中的推广和应用。此外,还存在因扩增效率不高导致的灵敏度较低等问题。为了解决这些问题,人们发明了无需昂贵的扩增仪器、扩增效率较高的核酸等温扩增技术。Lizardi等建立了滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)检测人类基因组DNA中的点突变,并得到了一定的应用。

近年来,RCA技术在食品病原菌的检测中得到了一定发展,但RCA要求模板为环状DNA,若扩增线性DNA,需要锁式探针和连接酶,操作步骤繁琐、反应时间长、成本很高,因此限制了RCA技术的推广。本实验发现Bst DNA聚合酶扩增DNA的一种新特性,该酶在一对引物的作用下,通过添加碱基的方式跨越靶序列两端的缺口,形成非闭合环状DNA,并进行开环式的滚环扩增,完成对线性DNA的扩增,以此为基础,与荧光染料相结合,采用可视化跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术。

本研究以hlyA基因为靶基因,通过大量实验筛选出了一对适宜的引物,建立一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的新型滚环扩增方法,即可视化SRCA,并对此方法进行评价,旨在为开发单核细胞增生李斯特氏菌SRCA检测试剂盒奠定基础,为食品中致病菌的快速检测提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本研究所用菌株如表1所示。

表 1 本研究所用菌种

菌株|北纳生物

1.1.2 试剂

细菌DNA提取试剂盒、Bst DNA聚合酶(Largefragment)、SYBR Green I荧光染料、Dra I限制性核酸内切酶 大连宝生物工程有限公司;Taq DNA聚合酶、Easypure® Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、基因克隆T3载体试剂盒、100 bp DNA Ladder、dNTPs 北京全式金生物技术有限公司;1%盐酸吖啶黄溶液、1%萘啶酮酸钠盐溶液、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定试剂盒、异丙醇、无水乙醇 北京陆桥技术股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2720 Thermal cycler核酸扩增仪 美国AppliedBiosystems公司;DYY-8C型电泳仪 北京市六一仪器厂;BILON-08无菌均质器 西安比朗生物科技有限公司;BINDA 2020D凝胶成像仪 北京宾达英创有限公司;NanoDrop 2000分光光度计 美国Thermo Scientific公司;BSC-1500IIB2-X生物安全柜 鑫贝西Biobase公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

hlyA基因的序列具有高度保守性,本研究选取hlyA基因为单核细胞增生李斯特氏菌的靶基因,根据GenBank公布的hlyA基因序列进行BLAST同源性分析,利用DNAMAMN和Primer Premier 5.0软件设计引物。

1.3.2 细菌的培养与DNA提取

将保存的各菌株(表1)接种到营养肉汤中,37 ℃过夜培养,再转接到营养琼脂平板上培养,挑取单菌落接种到营养肉汤中37 ℃过夜培养,备用。培养菌液采用试剂盒法提取基因组DNA。通过Nanodrop 2000分光光度计测定基因组浓度。

1.3.3 SRCA和PCR体系

优化建立最佳的SRCA扩增体系:5 μL dNTPs(4 种均为2.5 mmol/L),2.5 μL Mg2+(20 mmol/L),2 μL10×ThermoPol buffer,1 μL上游引物(10 μmol/L),1 μL下游引物(10 μmol/L),1 μL模板DNA(阴性对照不添加模板),1 μL Bst DNA聚合酶(320 U/mL),无菌去离子水补足体系至20 μL。94 ℃预变性3 min,冰浴2 min;然后62 ℃反应60 min;最后80 ℃反应5 min,反应停止。为评估SRCA方法的灵敏度和检出限,本研究同时应用了PCR方法。其反应体系(25 μL)如下:2×EasyTaq PCR Super Mix 11.0 μL,正反向引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL,剩余体积由无菌去离子水补足。反应程序:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s(变性-退火-延伸,25 个循环),72 ℃再延伸45 s终止。

1.3.4 SRCA产物可视化分析

向SRCA扩增产物中加入1 μL荧光染料SYBR Green I,直接肉眼观察颜色变化,进行可视化分析。1.3.5 SRCA扩增产物测序分析和酶切分析选取典型的梯形条带,自最小片段起依次切取4 个条带进行胶回收,反应产物纯化测序。为进一步验证SRCA产物是否为目的条带,本实验采用Dra I限制性内切酶对产物进行酶切验证,在37 ℃反应2.5 h。反应完成后进行凝胶电泳,以观察酶切结果。

1.3.6 SRCA引物特异性分析

为验证本研究中引物在SRCA反应中的特异性,共对52 株菌株进行分析,其中包括2 株单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株,10 株单核细胞增生李斯特氏菌株(实验室分离菌株)及40 株非单核细胞增生李斯特氏菌菌株(表1),并通过荧光可视法进行结果分析。

1.3.7 SRCA灵敏度分析

为评估SRCA检测纯菌DNA的灵敏度,取上述过夜培养的纯菌液1 mL提取模板DNA,并用无菌去离子水进行10 倍梯度稀释,进行扩增后,通过荧光可视法进行分析,确定SRCA反应的灵敏度。同时以PCR检测方法为对照,PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析,确定PCR的灵敏度。纯菌液经Nanodrop 2000分光光度计测定质量浓度为8.9×107 fg/μL。

1.3.8 SRCA人工污染凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌的检出限分析

称取经验证未受到单核细胞增生李斯特氏菌污染的凉菜25 g,加入单核细胞增生李斯特氏菌LB1增菌液中均质,取过夜培养的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株(CMCC 54001)的纯菌液1 mL,加入含有9 mL均质液的试管中,吹吸混匀,然后进行10 倍梯度的连续稀释。每个稀释度菌悬液均取1 mL,提取基因组DNA,SRCA方法扩增,通过荧光可视化法确定SRCA方法的检出限。

以PCR方法为对照,通过凝胶电泳法确定PCR方法的检出限。与此同时,另取1 mL上述纯菌液,用0.85%的生理盐水进行10 倍梯度的连续稀释,每个稀释度各取1 mL加入李斯特氏菌显色平板,36 ℃培养48 h,记录单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌落数。根据平板计数法获得人工污染的凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌浓度范围2.8×108~2.8×10-1 CFU/mL。

1.3.9 SRCA方法的实际应用与评估

为检验SRCA方法对实际样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检出情况,在当地各大超市及市场随机购买70 份易被单核细胞增生李斯特氏菌污染的样品,包括成品果蔬22 种、生食果蔬23 种、豆制品6 种、熟肉制品13 种、其他类型6 种,利用GB 4789.30—2016《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》、PCR及SRCA 3 种方法对以上样品进行检测。以GB 4789.30—2016检测结果为基准,采用敏感性、特异性及符合率3 个指标对SRCA方法进行评价。

相关链接:单核细胞增生李斯特氏菌,菌株,大肠埃希氏菌萘啶酮酸钠盐溶液肠炎沙门氏菌北纳生物

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