北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

检测单核细胞增生李斯特氏菌的新型滚环扩增方法(二)

发布时间:2021-10-13 16:26 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 荧光可视化法观察SRCA扩增产物

SRCA反应结束后,向反应管中加入1 μL的荧光染料SYBR Green I,结果如图2所示。添加了单核细胞增生李斯特氏菌的阳性反应管1颜色由橙色变为绿色,而阴性对照2仍为橙色。

SRCA荧光可视化结果|北纳生物

图 2 SRCA荧光可视化结果

2.2 SRCA扩增产物测序和酶切结果分析

如图3A所示,SRCA扩增产物经过Dra I限制性内切酶切消化后,其酶切片段为109 bp左右,与理论计算值一致。为了进一步验证SRCA产物,对图3A中的扩增产物电泳条带(1~4)进行测序分析。测序结果如图3B所示,发现SRCA的反应产物含有多个重复的特异性靶序列,且随着靶序列拷贝数目增加,产物片段长度随之增加。利用两条具有特异性的引物,通过SRCA反应可以特异性的扩增目的片段,因此,可以验证本研究中建立的SRCA方法检测单核细胞增生李斯特氏菌原理的正确性。

 单核细胞增生李斯特氏菌S|北纳生物

图 3 单核细胞增生李斯特氏菌SRCA反应的酶切和测序结果分析

2.3 SRCA方法的特异性

本研究针对52 株菌株进行特异性分析,检测结果如图4所示。其中,12 株单核细胞增生李斯特氏菌发生了SRCA反应,而其他40 株非单核细胞增生李斯特氏菌均未发生SRCA反应。说明该引物具有良好的特异性。SRCA检测方法的特异性取决于引物的设计和筛选,需要从设计出的大量引物中通过大量实验筛选出一对合适的引物,这也是本研究的难点。

2.4 单核细胞增生李斯特氏菌纯培养的灵敏度

以1.3.7节中提取的基因组DNA作为模板进行SRCA反应,向得到的反应产物中添加1 μL荧光染料SYBRGreen І。如图4A所示,在模板DNA质量浓度范围为8.9×107~8.9×100 fg/μL时,反应管中出现绿色,质量浓度小于8.9×100 fg/μL时仍然为橙色,因此,SRCA荧光可视法基因组灵敏度为8.9×100 fg/μL。用相同的模板进行PCR,得到的反应产物进行凝胶电泳。如图4B所示,在模板DNA质量浓度范围为8.9×107~8.9×103 fg/μL时,出现了阳性扩增条带,因此,PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌基因组的灵敏度为8.9×103 fg/μL。由此可知,SRCA方法检测的灵敏度是PCR方法检测灵敏度的1 000 倍。

检测的灵敏度|北纳生物
图 4 SRCA方法(A)和PCR方法(B)检测的灵敏度

2.5 人工污染凉拌菜单核细胞增生李斯特氏菌的检出限

利用SRCA和PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株污染的凉拌菜进行检测,结果如图6所示。反映了SRCA方法的检测结果,当人工污染的凉拌菜中菌浓测度为2.8×108~2.8×100 CFU/g时,反应管中出现绿色,当浓度为2.8×10-1 CFU/g时反应管中的颜色依然为橙色。因此,SRCA荧光可视法检出限为2.8×100 CFU/g。

实验结果反映了PCR方法检测的结果,当人工污染的凉拌菜中菌浓度为2.8×108~2.8×103 CFU/g时,出现了阳性扩增条带,菌浓度小于2.8×103 CFU/g时未出现扩增条带,因此,PCR方法检测人工污染凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌的检出限为2.8×103 CFU/g。由此可知,SRCA方法的检出限是传统PCR方法检出限的1/1 000。

2.6 实际样品的检测与SRCA方法的评估

表 3 SRCA方法评价

SRCA方法评价|北纳生物
注:—.无数据。

利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三种方法对70 份食品进行检测,结果见表3。SRCA和PCR方法均会出现假阳性,主要原因在于检测过程中无法区别死菌和活菌,传统培养方法不能检测出死菌和不可培养状态的菌株(viable but non-culturable,VBNC),而其DNA在SRCA和PCR方法中却可扩增,即通过SRCA和PCR方法可以检测到死菌及VBNC状态的单核细胞增生李斯特氏菌。除此之外,由于SRCA方法检测的灵敏度更高,因此出现的假阳性数量比PCR方法多。

3 结 论

本研究筛选出了一对适宜的引物,成功建立了SRCA快速检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法,并通过肉眼观察荧光判断结果,方便简单。利用SRCA技术对12 株单核细胞增生李斯特氏菌和40 株非单核细胞增生李斯特氏菌进行特异性检测,其中12 株单核细胞增生李斯特氏菌显示为阳性,其他均显示阴性结果,证明该方法具有较好的特异性。SRCA技术检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为8.9×100 fg/μL,是传统PCR方法的1 000 倍,人工污染凉拌菜样品中的单核细胞增生李斯特氏菌检出限为2.8×100 CFU/g,是传统PCR方法的1/1 000,因此SRCA技术具有更高的灵敏度和更低的检出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法对70 种实际样品进行单核细胞增生李斯特氏菌的检测,并以GB 4789.30—2016法为标准对SRCA方法进行评估,其敏感性为100%,特异性为97.01%,符合率为97.14%。

本研究建立的SRCA方法用于检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测切实可行,SRCA方法具有操作简便、节省时间、成本低廉、灵敏度高、稳定性好的优势。说明SRCA方法非常适合在中小型企业和基层检测机构以及现场快速检测中推广应用。在后期的研究中,SRCA方法可与叠氮溴化丙锭[29]、叠氮溴化乙锭等结合,区分死活菌,进一步实现结果判断的准确性。开发单核细胞增生李斯特氏菌SRCA检测试剂盒,大力推广该技术。

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