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白假丝酵母环核苷酸磷酸二酯酶2的纯化与酶学特性分析

发布时间:2021-01-08 16:11 作者:陈丹
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白假丝酵母(Candida albicans)属于食源性致病酵母菌,近年来在国内外食品中常检出C. albicans,其中乳制品是易被其污染的第一大类产品。C. albicans在正常情况下呈卵圆形,不引起疾病,而当机体免疫力低下或菌群失调时,会改变生长形式,出芽生成假菌丝并感染机体细胞,最终导致生理性疾病的发生。C. albicans作为食品中的条件致病菌,其致死率可达40%,所以对其毒性和菌丝生长的研究极为重要。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosinc monophosphate,cGMP)作为生物体内第二信使调控着重要的生理代谢反应,而磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)是降解环核苷酸的一类酶。在哺乳动物细胞中存在约30 种PDE,但是在真菌生物中,目前仅有两类PDE被发现,其中PDE1属于II类PDE超家族成员,而PDE2属于I类PDE超家族成员,其对cAMP具有较高的亲和力,且PDE2与人类PDEs蛋白具有相似的折叠结构。

研究表明,cAMP信号通路在酵母的细胞壁合成、细胞生长等生长代谢活动以及致病毒性中起到重要作用。同时,Wilson等对C. albicans PDE的研究表明,pde2基因的缺失会导致菌丝发育不完全和细胞壁不完整,从而对其毒性产生影响;有学者证明部分抑菌剂对C. albicans抑菌作用的主要机制是抑制PDE2蛋白的表达。所以目前对C. albicans PDE2蛋白的研究已成为其假菌丝生长和毒性调控的重要研究方向。本研究将大肠杆菌作为表达载体,通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导目的蛋白异源表达,利用3 种层析方法进行纯化,获得高纯度C. albicans PDE2蛋白,并通过高效液相色谱(highperformance liquid chromatography,HPLC)分析PDE2蛋白酶的特性。旨在为该蛋白的晶体学分析及C. albicans的生理病理机制研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌体与质粒

野生型C. albicans,大肠杆菌感受态细胞Top10、BL21,质粒pET28a和pGEM-T,均为本实验室保存。

1.1.2 试剂

NheI、EcoRI内切酶 美国Biolab公司;DNA回收试剂盒、高纯质粒小提试剂盒、DNA分子质量标准Marker 美国Thermo公司;cAMP、cGMP、卡那霉素、Tris-base 美国Amresco公司;乙二胺四乙酸钠中国北京西陇化工有限公司;氯仿国药集团化学试剂有限公司;X-gal 美国Sigma公司;IPTG 美国ThermoFisher Scientific公司;酵母浸粉、胰蛋白胨 北京奥博星生物技术有限公司;氯化钠 北京化工厂;琼脂中国Biotopped公司。Ni-NTA agarose 德国Qiagen公司;Q-SepharoseTMFast Flow、SephacrylTM S200 High Resolution 美国GE Healthcare公司。

1.2 仪器与设备

French PressSL-650D超声破碎仪 南京顺流仪器公司;层析实验冷柜 北京博医康实验仪器有限公司;HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司;PHS-3DpH计 上海仪表有限公司;Forma Class II净化工作台美国Thermo公司;5810R台式冷冻高速离心机 德国Eppendorf公司;2695 HPLC仪 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA提取

C. albicans在酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extractpeptone dextrose,YPD)培养基中28 ℃、200 r/min条件下培养过夜,A600 nm达到2.0~3.0后离心集菌,并参照王继英等[20]的酚-氯仿法提取C. albicans的基因组DNA。

1.3.2 重组质粒载体的构建

根据C. albicans pde2基因序列(NCBI Gene ID:3636877)设计引物,该基因CDS序列全长为1 716 bp[21]。上游引物序列为:5’-CGGCTAGCATGTCATTTGAAATCACAAT-3’(下划线为NheI酶切位点);下游引物序列为:5’-CGGAATTCTACTATAATTGAGGTGCCAC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)。引物扩增目的基因片段连接至pGM-T载体,采用热激法转化至大肠杆菌Top10感受态细胞,37 ℃培养16 h进行菌落PCR扩增,鉴定插入片段。将已鉴定目的基因片段连接到pET28a载体上,最终获得pET28a-C. albicans pde2重组质粒,重组质粒通过NheI和EcoRI双酶切鉴定。

1.3.3 pET28a-C. albicans pde2重组质粒诱导表达

将pET28a-C. albicans pde2重组质粒转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经37 ℃过夜培养后,接种至含0.4%葡萄糖的LB培养基中。0.1 mmol/L IPTG 12 ℃低温诱导48 h后,10 000 r/min离心5 min收集菌体。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析诱导0、24、48 h菌体中目的蛋白的表达含量。

1.3.4 C. albicans PDE2蛋白分离纯化

1.3.4.1 菌体破碎

按照1∶10的比例加入提取液并重新悬浮收集的表达菌体,超声破碎(工作5 s,间歇8 s)菌体30 min,LI Chixia, CHEN Ying, ZHANG Meng, et al. Heterologous expression, purification and enzymatic analysis of Candidaalbicans cyclic nucleotide phosphodiesterase 2[J]. Food Science, 2020, 41(22): 82-87. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20191012-092. http://www.spkx.net.cn10 000 r/min离心30 min后,分别对破碎总蛋白、上清液蛋白以及沉淀蛋白进行SDS-PAGE检测。

1.3.4.2 基于重组蛋白多重性质的分离纯化

参照Zhang Wei等[24]的方法进行Ni-NAT柱分离纯化,将超声破碎上清液蛋白加入至Ni-NAT柱吸附并洗脱收集目的蛋白。Ni-NAT纯化后的C. albicans PDE2蛋白透析置换24 h后,加入牛凝血酶于室温酶切3 h。酶切后的蛋白加入Q-Sepharose柱进行分离纯化后,超滤浓缩至10 mL左右。浓缩蛋白进行Sephacryl S200分子筛纯化[25]。Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分离纯化过程中测定蛋白收集液的A280 nm,A280 nm等于1被定义为蛋白浓度为1 U,收集蛋白进行SDS-PAGE和非变性凝胶电泳检测分析。最终蛋白浓缩至10 mg/mL并冷冻保存。

1.3.5 C. albicans PDE2蛋白酶活力测定

分离纯化的C. albicans PDE2蛋白应用HPLC进行酶学特性测定,参照Hou Jing等方法。反应体系采用单一底物和双底物两种方式检测重组蛋白的酶活特性,反应温度25 ℃,反应时间30 min。根据cAMP和cGMP的峰面积,计算反应底物的水解率。

色谱条件:色谱柱:Intertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相A为0.02 mol/L KH2PO4溶液,流动相B为甲醇,洗脱条件为82% A、18% B。检测波长252、258 nm,柱温30 ℃,流速1 mL/min,进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 C. albicans pde2基因克隆

运用酚-氯仿法提取C. albicans基因组DNA,结果见图1a,在10 000 bp以上有明显条带,证明成功获得了C. albicans基因组DNA。利用C. albicans pde2基因引物,通过PCR扩增目的基因片段,DNA凝胶电泳如图1b所示,在1 500~2 000 bp之间有明显的条带,大小与C. albicans pde2基因的大小(1 716 bp)一致,证明目的基因片段可以被正确扩增。

                                  图 1 C. albicans基因组DNA(a)及目的基因PCR扩增产物(b)凝胶电泳

2.2 重组质粒载体构建

将扩增所得C. albicans pde2目的片段与pGM-T载体相连,双酶切验证电泳结果见图2a,3 000 bp处条带为载体pGM-T条带,1 700 bp处条带为目的基因条带,证明成功获得pGM-T-C. albicans pde2质粒。将酶切后胶回收产物与pET28a载体酶切产物连接,获得重组pET28a-C. albicans pde2质粒。对所构建的重组质粒进行双酶切验证,由图2b可知,酶切后在6 000 bp和1 700 bp左右有明显条带,其中6 000 bp处为pET28a质粒载体条带,1 700 bp左右的条带为目的基因条带,证明重组pET28a-C. albicans pde2质粒构建成功。


                              图 2 C. albicans pde2目的基因PCR扩增产物与质粒双酶切琼脂糖凝胶电泳

重组质粒诱导表达IPTG低温诱导48 h后收集菌体5 g/L,分别取样诱导24 h和48 h的菌体,SDS-PAGE见图3。诱导24 h,蛋白表达量较少,几乎没有目的蛋白条带。诱导48 h后,60 kDa处蛋白含量显著增加,该条带与预期目的蛋白(约62 kDa)条带一致,表明该诱导条件能够在IPTG诱导48 h后获得大量的目的蛋白,最终获得菌体4.5 g/L。

                               图 3 C. albicans PDE2蛋白不同诱导时间表达水平SDS-PAGE分析

2.4 C. albicans PDE2蛋白的分离纯化

将C. albicans PDE2表达菌体超声破碎后取样进行SDS-PAGE,结果如图4a所示,离心上清液中目的蛋白含量极高,证明该诱导条件下目的蛋白水溶性较强,形成极少量的包涵体。将离心上清液蛋白加入Ni-NAT亲和层析柱中进行分离纯化,最终获得70 U蛋白。对蛋白含量大于1 U收集管取样进行SDS-PAGE,结果见图4b,目的蛋白条带占比高,说明重组目的蛋白与Ni-NAT柱亲和能力强,且经过蛋白纯度明显升高。证明Ni-NAT柱能够对目的重组蛋白进行有效的分离纯化。

                                  图 4 C. albicans PDE2蛋白超声破碎及Ni-NAT纯化SDS-PAGE结果

Ni-NAT柱分离纯化后的蛋白,进行24 h的透析置换。牛凝血酶切除目的蛋白的His-tag标签,使目的蛋白更好地与Q-Sepharose柱结合,结果见图5a,经过3 h的室温酶切,蛋白分子质量有明显降低,证明该酶切条件适合重组目的蛋白。酶切后的蛋白质经过Q-Sepharose柱分离纯化,共收集目的蛋白55U,结果如图5b所示,电泳结果几乎没有杂蛋白条带,说明杂蛋白的含量明显降低,因此证明Q-Sepharose柱可以使目标蛋白得到进一步分离纯化。

                          图 5 C. albicans PDE2蛋白酶切(a)及Q-Sepharose柱纯化(b)SDS-PAGE结果

将Q-Sepharose柱纯化的蛋白浓缩并加入SephacrylS200柱,通过分子筛分离纯化,SDS-PAGE检测结果如图6a所示,Sephacryl S200柱纯化后,目的蛋白纯度得到进一步提高。利用非变性凝胶电泳检测浓缩后纯化蛋白的活性,如图6b所示,结果表明经过多步纯化后,目的蛋白条带清晰可见且没有杂蛋白条带,说明Ni-NAT柱、Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱分离纯化过程中C. albicans PDE2蛋白没有发生凝聚,能够维持其生理结构和生物学活性,且蛋白纯度得到极大提高。

             图 6 C. albicans PDE2 Sephacryl S200柱纯化SDS-PAGE(a)及非变性凝胶电泳(b)结果
 


                                            表 1 C. albicans PDE2蛋白纯化回收率

以Ni-NTA柱纯化得到的蛋白含量为100%,计算Q-Sepharose柱和Sephacryl S200柱纯化过程中蛋白的回收率。如表1所示,C. albicans PDE2蛋白在每步纯化过程中,损耗约30%蛋白,这可能是由于蛋白纯度的增高导致,同时在经历柱层析时,目的蛋白也存在着一定量的流失。最终平均每克表达菌体可获得2.8 U目的蛋白。

2.5 C. albicans PDE2蛋白酶活性分析

应用HPLC法测定所获得的目的蛋白酶活力,测定不同浓度蛋白对cAMP和cGMP的水解率,且将底物设置为0.4 mmol/L的单底物与双底物两种体系,通过其对两种体系的水解情况,确定其对于cAMP和cGMP的亲和作用,结果如表2所示。在单底物的情况下,相同质量浓度的C. albicans PDE2对cGMP的水解能力略低于cAMP,说明C. albicans PDE2对cAMP具有更高的亲和力。在双底物的体系中,0.385 mg/mL质量浓度下,0.05 mmol/L和0.1 mmol/L浓度的cAMP能够被完全水解,但0.05 mmol/L浓度的cGMP水解率仅达到了53.53%,说明双底物体系中C. albicans PDE2优先水解cAMP。因此,两种体系均证明了C. albicans PDE2对cAMP具有更高的亲和力。

                                             表 2 不同质量浓度C. albicans PDE2对底物的水解率


3 结 论

目前,广大研究学者对真菌的调控进行了广泛研究,其中环核苷酸磷酸酶PDE能够对真菌起到重要的调控作用。如Zhang Haifeng等对稻瘟病菌的毒性作用机制的研究中,发现两种pdeL/pdeH基因对菌丝生长、孢子生成等起到重要调控作用;有研究通过过量表达酵母菌的pde2基因,使酵母具有较高的乙醇耐受性。因此以上结论充分证明了真菌胞内PDE2对于菌体的生长代谢及致病性有着重要的调控作用。本研究通过IPTG诱导大量表达蛋白菌体,通过多种柱层析手段对目的蛋白进行分离纯化,最终得到高纯度的C. albicans PDE2蛋白,平均每克表达菌体可获得2.8 U蛋白。通过HPLC检测底物减少量或产物生成量分析蛋白酶的水解能力,从而确定所获得的酶活力。结果表明所纯化的蛋白具有较高的水解cAMP和cGMP的能力,其在0.385 mg/mL质量浓度下,对0.4 mmol/L的cAMP和cGMP的水解率达到60%~70%,这与前期报道酿酒酵母PDE1作用方式一致。但是该酶对cAMP的亲和力高cGMP。本研究得到高纯度、高活性的C. albicans PDE2,为蛋白的晶体学解析提供前期基础,以期进一步筛选以该酶为靶点的天然活性物质,以及解析食品中C. albicans的生长和致病性调控机制。

相关链接:白假丝酵母环核苷酸磷酸二酯酶,,酵母细胞葡萄糖十二烷基硫酸钠北纳生物

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