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布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化(一)

发布时间:2021-02-20 18:14 作者:陈丹
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γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种非蛋白质氨基酸,广泛存在于自然界中。GABA作为哺乳动物大脑中的主要抑制性神经递质,具有降血压、抗癫痫、抗抑郁、镇静、预防糖尿病、预防肥胖和促进睡眠等功能。由于其潜在的生物活性,富含GABA的功能性新食品的开发受到越来越多研究者的关注。生产GABA的方法主要包括化学合成法和生物合成法,由于化学合成法存在生产成本高、反应不容易控制、副产物成分复杂且有害等缺点,因化学合成的GABA很难用于食品工业,而生物合成法则具有反应条件温和、环境污染小、安全性高等优点,具有较大的生产食品级GABA的潜力。

多种微生物都可以合成GABA,包括细菌、真菌和酵母,而乳酸菌作为安全的食品微生物,已广泛用于发酵食品的生产中,其GABA产生能力研究也最为广泛。此外,部分乳酸菌菌株还具有免疫调节、抑制病原菌以及控制肠道菌群平衡等生物活性。从日本传统发酵食品、韩国黑莓汁、朝鲜发酵泡菜、西班牙奶酪和意大利奶酪中分别分离出的副干酪乳杆菌NFRI 7415、短乳杆菌GABA 100、布氏乳杆菌MS、乳酸乳球菌CECT 8184和植物乳杆菌C48均已被报道可产GABA。王兴洁等从四川泡菜中筛选出1 株产GABA的植物乳杆菌W1-9,以黄瓜汁为发酵培养基,其GABA产量可达到7.62 g/L;黄德娜等从独山盐酸菜液中筛选出1 株产GABA的棉籽糖乳球菌Y-12,其GABA产量为4.06 g/L;Komatsuzaki等从日本发酵水产品分离获得了1 株产GABA的副干酪乳杆菌NFRI 7415,其在底物浓度为500 mmol/L时,GABA产量为302 mmol/L;Li Haixing等从中国泡菜中分离获得了1 株高产GABA的短乳杆菌NCL912,其在补料分批发酵之后,GABA产量高达102.78 g/L左右;Shan等从内蒙古发酵乳中分离获得了1 株产GABA的副干酪乳杆菌NDC75017,其GABA产量最高可达314.56 mg/100 g。

泡菜和酸菜作为中国传统的发酵蔬菜,其中含有多种乳酸菌,而关于中国传统发酵蔬菜来源的布氏乳杆菌产GABA的特性还鲜见报道。本研究旨在对前期从泡菜和酸菜中分离获得的2 株布氏乳杆菌产GABA的发酵条件进行优化,提高其GABA产量,为进一步开发高产GABA的功能性微生态制剂或富含GABA的发酵食品奠定理论基础和提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

布氏乳杆菌S37和布氏乳杆菌J68筛选自中国传统发酵蔬菜,经生工生物工程(上海)股份有限公司进行分子生物学鉴定,保藏于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。

M R S 肉汤培养基 北京陆桥技术有限公司;GABA标准品(99%)、L-谷氨酸钠(L-monosodium glutamate,L-MSG)、丹磺酰氯 美国Sigma-Aldrich 公司;甲醇、丙酮、叶酸、L-半胱氨酸、氯化锰(均为色谱级) 中国上海Aladdin公司;其他试剂均为分析纯,购自四川西陇化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20A型高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、UV-2600型紫外分光光度计 日本岛津公司;ZXDP-B2160型恒温培养箱 上海智诚有限公司;HC-3018R型低温高速离心机 安徽科大中佳有限公司;DK-98IIA 型电热恒温水 浴锅 上海沪粤明科学仪器有限公司;YT-CJ-2ND型超净工作台 北京亚泰科隆仪器技术有限公司;涡旋振 荡器 美国Scientific Industries公司;YXQ-LS-70A型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

将-80 ℃甘油管中保存的菌株解冻后,取50 μL接种于含8 mL MRS肉汤培养基的试管中,于36 ℃静置培养18 h,活化3 代后,用于后续的发酵实验。

1.3.2 布氏乳杆菌产GABA发酵条件的优化

1.3.2.1 发酵时间对GABA产量和细胞生长的影响

发酵温度35 ℃,MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L,初始pH 5.0,考察发酵时间(24、48 h和72 h)对GABA产量的影响。发酵结束后,通过HPLC测定发酵液中的GABA含量,同时测定发酵液在600 nm波长处的光密度(OD600 nm),记录细菌细胞的生长情况。

1.3.2.2 发酵温度对GABA产量和细胞生长的影响

发酵时间72 h,MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L,初始pH 5.0,考察发酵温度(25、30、35 ℃和40 ℃)对GABA产量的影响。发酵结束后,通过HPLC测定发酵液中的GABA含量,同时测定发酵液OD600 nm,记录细菌细胞的生长情况。

1.3.2.3 L-MSG浓度对GABA产量、L-MSG转化率和细胞生长的影响

发酵时间72 h,发酵温度35 ℃,初始pH 5.0,考察底物浓度(50、100、200、400 mmol/L和600 mmol/L)对GABA产量的影响。发酵结束后,通过HPLC测定发酵液中的GABA含量,同时测定发酵液OD600 nm,记录细菌细胞的生长情况。L-MSG转化率的计算公式如下:


式中:A为发酵液中GABA最终浓度;B为发酵液中L-MSG初始添加浓度。

1.3.2.4 初始pH值对GABA产量和细胞生长的影响

发酵时间72 h,发酵温度35 ℃,MRS肉汤培养基中L-MSG浓度400 mmol/L,考察初始pH值(4.5、5.0、5.5和6.0)对GABA产量的影响。发酵结束后,通过HPLC测定发酵液中的GABA含量,同时测定发酵液OD600 nm,记录细菌细胞的生长情况。

1.3.3 影响GABA产量的响应面试验优化

在布氏乳杆菌产GABA最优发酵条件的基础上,根据不同的营养成分对2 株布氏乳杆菌产GABA影响的单因试验结果,筛选出影响合成GABA的主要因素,即叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量,并确定了其合适的水平范围。以GABA产量为评价指标,以叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量为考察因素,进行3因水平 Box-Behnken响应面试验,因素与水平见表1。

表 1 Box-Behnken试验因素与水平

1.3.4 GABA含量测定

参照Liu Sijin等HPLC法测定发酵液中GABA含量。首先对发酵液进行前处理,发酵液于8 000h g离心10 min,取上清液,进行适当稀释,取50 μL样品,与0.5 mL 20 g/L碳酸氢钠溶液和0.5 mL 5 g/L丹磺酰氯丙酮溶液混合,涡旋混匀30 s,60 ℃避光温育30 min,然后向反应混合物中加入100 µL氨水以除去过量的衍生试剂,最后添加甲醇将体积调至2 mL,过0.22 µm有机滤膜,取20 µL品进行HPLC分析。空白对照为不接菌的含有50 mmol/L L-MSG的MRS肉汤培养基。

色谱条件:色谱柱为Agilent TC-C18反相色谱柱(250 mmh 4.6 mm,5 µm);检测器为紫外检测器,检测波长254 nm;流动相A为含50 mmol/L乙酸钠的四氢呋喃-甲醇-水溶液(1∶15∶84,V/V),用磷酸调节pH 6.2;流动相B为甲醇。梯度洗脱条件为流动相B 在0~25 min内,从10%线性升至45%,维持2 min,27~28 min升至90%,维持5 min,然后在1 min内降到10%,维持7 min,整个梯度洗脱程序持续41 min。柱温35 ℃;流速1 mL/min;进样量20 μL。

1.4 数据处理

实验重复3 次,数据表示为f s。利用SPSS 19.0软件进行统计学分析,采用一维方差分析统计组间的显著性差异,组间多重比较采用Tukey法,P<0.05,差异显著。使用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计并进行相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析


图 1 GABA标准品(A)和发酵液样品(B)的HPLC分析图谱

标准品浓度为50 mmo/L,上样量为20 µL。

如图1所示,在本实验色谱条件下GABA色谱峰峰形尖锐和对称,无拖尾现象,与样品基质色谱达到了有效分离。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 发酵时间对GABA产量和细胞生长的影响


图 2 发酵时间对GABA产量(A)和细胞生长(B)的影响

同一株菌字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

由图2A可知,在24~72 h内,随着发酵时间的延长,2 株布氏乳杆菌的GABA产量均逐渐增加。发酵时间在前48 h内,GABA产量增加迅速,在48~72 h之间产量增加缓慢,但增长仍显著(P<0.05)。由图2B可知,布氏乳杆菌J68在发酵48 h后依然显著增长,而布氏乳杆菌S37在发酵第48小时已经进入了稳定生长期,但依然可以将培养基中剩余的L-MSG缓慢转化为GABA。由此0可知,布氏乳杆菌产GABA可能并不是严格依赖于细菌细胞的生长,并且选择72 h作为后续产GABA的发酵时间。

相关链接:γ-氨基丁酸哺乳动物布氏乳杆菌副干酪乳杆菌短乳杆菌盐酸植物乳杆菌泡菜L-半胱氨酸氯化锰菌株发酵北纳生物

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