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布氏乳杆菌产γ-氨基丁酸发酵条件的优化(二)

发布时间:2021-02-20 18:33 作者:陈丹
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2.2.2 发酵温度对GABA产量和细胞生长的影响

温度对布氏乳杆菌GABA产量和细胞生物量有较大影响。由图3可知,2 株布氏乳杆菌的GABA产量和菌体量的变化趋势基本一致,即在25~35 ℃之间,随着温度的升高而增加,并且在35 ℃达到最高值,随后随着温度的升高而降低。对于S37,在不同的发酵温度(30、35、40 ℃)下,GABA产量未发现显著差异,且菌体量有着较小的差异,并且发酵温度为35 ℃时,GABA产量达到最高。对于J68,尽管菌体量在30 ℃和35 ℃之间没有显著差别,且超过35 ℃时菌体量开始缓慢下降,而其GABA产量在35 ℃略高于40 ℃,明显高于30 ℃。这些结果表明,GABA产量在一定情况下取决于菌株的生物量,后续选择35 ℃作为最适发酵温度。这与之前的研究结果基本一致,李海星优化从中国泡菜分离的短乳杆菌NCL912发酵条件之后的最适温度为32 ℃,Lu Xiaoxue等优化从中国传统卷心菜泡菜分离的乳酸乳球菌发酵条件发现最适温度是34 ℃,而且Dhakal等也报道称乳酸菌生长细胞产GABA的最适发酵温度在30~40 ℃之间。

图 3 发酵温度对GABA产量(A)和细胞生长(B)的影响

2.2.3 L-MSG浓度对GABA产量、L-MSG转化率和细胞生长的影响

在一些乳酸菌中,L-谷氨酸或其钠盐可在谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)作用下发生不可逆的脱羧反应从而合成GABA[30]。由图4A可知,L-MSG浓度在50~400 mmol/L时,2 株布氏乳杆菌的GABA产量逐渐增加,底物浓度为400 mmol/L时,GABA产量达到最高,分别为233.9 mmol/L 和159.3 mmol/L,对应的L-MSG转化率分别为58.5%和39.8%,当L-MSG浓度在400~600 mmol/L时,GABA产量及L-MSG转化率均显著降低。由图4B可知,随着L-MSG浓度的增加,对应的L-MSG转化率会持续降低。由图4C可知,当L-MSG浓度超过100 mmol/L时,菌体量开始减少。因素GABA产量的降低可能是由于高浓度的L-MSG抑制了细菌生长和谷氨酸脱羧酶活性。上述结果表明,将底物高效转化为GABA不仅需要高菌体量,还需要适当的初始L-MSG浓度,所以综合考虑,布氏乳杆菌产GABA的最佳L-MSG浓度为400 mmol/L。


图 4 L-MSG浓度对GABA产量(A)、L-MSG转化率(B)和 细胞生长(C)的影响

2.2.4 初始pH值对GABA产量和细胞生长的影响

微生物生物合成 GABA受到严格的pH值调控,而且在发酵过程中具有显著作用,保持乳酸菌谷氨酸脱羧酶活性的最佳pH值在4.5~6.0之间。由图5可知,初始pH值对GABA产量和细胞生长具有显著影响。当pH值低于或高于5.0时,GABA产量和细胞生物量均迅速下降,即布氏乳杆菌产GABA的最佳初始pH值为5.0,这与先前关于乳酸菌生长细胞生产GABA的最佳初始pH值的报道一致。然而由于在通过特异性转运蛋白摄取底物后,细胞质脱羧会导致细胞内质子的消耗以及细胞外谷氨酸交换到GABA等更为碱性的底物,发酵液的pH值会随着发酵先下降后略有增加。因此,通过控制发酵过程中pH值,GABA生产效率将会更大提高。


图 5 初始pH值对GABA产量(A)和细胞生长(B)的影响

2.3 重要营养成分优化

2.3.1 关键因素及其合适添加量范围的确定

表 2 叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰添加量对菌株GABA产量的影响

注:同一因素同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

在确定最优的发酵条件之后,通过筛选确定了叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰为促进菌株GABA产生的关键化学添加物。将其按照不同水平添加到发酵培养基中,然后在确定的最优发酵条件下进行发酵实验。如表2所示,叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰在适当质量浓度范围下均能显著提高菌株GABA产量。当叶酸添加量低于10 mg/L 时,GABA产量随添加量增加而升高,当添加量超过10 mg/L时,GABA产量开始下降;当L-半胱氨酸添加量低于1.4 g/L时,菌株的GABA产量随添加量增加而升高,当添加量超过1.4 g/L时,GABA产量保持稳定不变;当氯化锰添加量低于0.6 g/L时,菌株GABA产量随添加量增加而升高,当添加量超过0.6 g/L时,GABA产量开始下降。

2.3.2 响应面优化

2.3.2.1 Box-Behnken设计方案及结果

利用响应面法考察3 个因素的交互作用,并利用模型预测GABA产量最高时各因素的水平。以叶酸添加量(A)、L-半胱氨酸添加量(B)和氯化锰添加量(C)作为自变量,GABA产量(Y)为响应值,根据 Box-Behnken设计进行了17 组试验,其中5 组中心点重复,试验结果见表3。

表 3 Box-Behnken试验设计及结果

2.3.2.2 模型的建立与方差分析

利用Design-Expert V8.0.6软件对表3中数据分别进行回归拟合分析,结果如表4、5所示。两个模型的P值均小于0.000 1,失拟项P值均大于0.05,表明回归模型极显著。预测值与试验值之间有很好的相关性,R2值分别为0.990 5和0.992 8。由F值可知,各因素对菌株S37产GABA的影响大小为:氯化锰添加量(C)>叶酸添加 量(A)>L-半胱氨酸添加量(B);而对菌株J68产GABA的影响大小为:氯化锰添加量(C)>L-半胱氨酸添加量(B)>叶酸添加量(A)。经回归拟合,分别得到2 株菌Y1和Y2的次多元回归方程:

表 4 菌株S37 Box-Behnken试验方差分析

注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。下同。

表 5 菌株J68 Box-Behnken试验方差分析


2.3.2.3 最优因素水平确定及验证

利用Design-Expert V8.0.6软件对回归模型进行极值求取分析,发现对于菌株S37,叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰的最优添加量分别为8.37 mg/L、0.94 g/L和 0.60 g/L,对于菌株J68,叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰最优添加量分别为10.16 mg/L、0.97 g/L和0.60 g/L。模型预测的最高产量分别为323.3 mmol/L和261.4 mmol/L。在最佳水平下进行验证实验,发现菌株S37和J68的实际GABA产量分别为312.6 mmol/L和251.2 mmol/L,对应的L-MSG转化率分别为78.2%和62.8%,与预测值基本一致,表明响应面试验建立的模型具有较高的准确度。与未添加上述物质的对照培养基相比,2 株菌的GABA产量分别提高了34%和58%。尽管在发酵过程中未使用发酵罐控制发酵系统的pH值,也未采用分批补料发酵模式,但2 株菌的GABA产量也高于大多数文献报道的乳酸菌的GABA产量。由于优化后布氏乳杆菌S37的GABA产量显著高于氏乳杆菌J68,因布氏乳杆菌S37更具有潜在的工业应用价值。

3 结 论

本研究以中国传统发酵蔬菜来源的2 株布氏乳杆菌为研究对象,研究不同发酵条件对布氏乳杆菌GABA产量和菌株生长的影响,结果表明2 株菌S37和J68具有相似的变化趋势,且其产GABA的最优发酵条件一致:发酵时间72 h、发酵温度35 ℃、底物L-MSG浓度 400 mmol/L、初始pH 5.0。培养基中添加叶酸、L-半胱氨酸和氯化锰能显著提高2 株菌的GABA产量,通过响应面试验优化其添加量后,其GABA产量分别为 312.6 mmol/L和251.2 mmol/L,对应的L-MSG转化率分别为78.2%和62.8%。布氏乳杆菌S37具有更高的GABA产量,具有进一步开发利用的潜力。

相关链接:发酵布氏乳杆菌细胞短乳杆菌,L-半胱氨酸,乳酸乳球菌L-谷氨酸氯化锰叶酸添加量菌株北纳生物

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