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菌株种子液的制备
2017-12-18 来源:北纳创联

1、 材料

1.1 供试菌株:拮抗菌株 B16 由课题组从人参植株根内部分离得到,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(B. methylotrophicus),人参锈腐病病原菌 C. destructans 由吉林农业大学农学院植物病理教研室提供。

1.2 培养基:供试细菌的保存和培养使用营养琼脂 NA (Nutrient agar)培养基[13];供试细菌液体发酵培养使用营养肉汤 NB (Nutrient broth)基础培养基[13];病原真菌的保存和培养使用马铃薯葡萄糖琼脂 PDA (Potato dextrose agar)培养基[14];种子液培养基使用改进的 NA 培养基(g/L):蛋白胨 10.0, NaCl 5.0,1×105 Pa 高压灭菌 30 min。

1.3 主要仪器和试剂:YXQ-LS-100A 立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗器械厂;SW-CJ-2FD 型超净工作台,苏州净水设备有限公司;DHP-9082 型恒培养箱,宁波海曙赛福实验仪器厂;UVS-1 型振荡混匀器,厦门亿晨科技有限公司;HH-6 型数显恒温水浴锅,常州中捷实验室仪器制造有限公司;SHZ-82A 恒温振荡摇床,上海智城分析仪器制造有限公司;3K-30 高速台式离心机,德国 Sigma 公司。酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨,北京奥博星生物技术有限责任公司;葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖等,国药集团化学试剂公司;琼脂粉和无机盐类,北京化工厂。

2、 方法

 2.1 菌株B16种子液的制备:将保存的拮抗菌株 B16 在 NA 培养基上进行活化,取活化后的菌株一环于装有 50 mL 种子液培养基的 250 mL 三角瓶中,30 °C、180 r/min 振荡培养 24 h,调整菌液浓度为 108 CFU/mL,即为备用种子液。

2.2 活菌数及抑菌活性的测定:活菌数的测定采用平板计数法;抑菌活性测试以人参锈腐病菌为指示菌,采用纸片扩散-抑菌圈法进行发酵液抑菌活性测定。将 4 °C 保存的人参锈腐病菌转接到 PDA 培养基上,25 °C 恒温培养 7 d 使其产生大量孢子,用无菌水将孢子洗下,孢子浓度调至 1×106 孢子/mL,将 200 µL 的孢子悬浮液均匀涂布于盛有 25 mL PDA 培养基上,无菌条件下吹干后制成带菌平板。前 1 天将滤纸片(Φ=5 mm)置于无菌发酵滤液(将发酵液 4 °C、10 000 r/min 离心 10 min,上清液经 0.45 µm 滤膜过滤后即为无菌发酵滤液)中过夜,使其充分吸收,微风略吹干后平放于带菌平板的中央,3 次重复,以相应的无菌培养液处理为对照。28 °C 恒温培养 3 d 后用十字交叉法测量菌落直径大小,并根据菌落直径大小计算抑菌率。抑菌率(%)=(供试菌落直径−对照菌落直径)/供试菌落直径×100。

 

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