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薯蓣丸对化疗后乳腺癌的影响研究
2018-08-29 来源:北纳生物

胎牛血清

<胎牛血清>

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1实验动物

SPF 级 BALB/c 雌性 6 周龄小鼠32 只,体重(20±2)g

1.1.2实验细

4T1 小鼠乳腺癌细胞株

1.1.3实验药品

①薯蓣丸(中药),具体配方 :大枣 30 g,白蔹、干姜各 3 g,防风、茯苓、生晒参、桔梗、杏仁、白术、芍药、麦门冬各 5 g,大豆卷、柴胡、川芎、桂枝、阿胶各 6 g,神曲、干地黄、当归各 10 g,甘草 18 g、薯蓣 20 g。按质量标准制成流浸膏于 4℃冰箱存储。②多西他赛(化疗药物)。

1.1.4实验试剂

培养基(型号 :RPMI 1640)、胎牛血清,胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS),Foxp3/Transcription Factor、Staining Buffer Set Kit试剂盒

1.1.5实验仪器

EPICL XL 型流式细胞仪,PM-10AD 光学显微镜及照相系统。

1.2 方法

1.2.1实验动物分组

随机将 32 只 BALB/C 雌性小鼠分为对照组、模型组、化疗组、中药组,各组8 只。

1.2.24T1 乳腺癌小鼠模型的复制

将 4T1 细胞株与完全培养基混悬(含 90% RPMI 1640 + 10% 胎牛血清)后,置于 5% CO 2 二氧化碳恒温细胞培养箱中,待细胞生长至 80% ~ 90% 予以传代。取对数期的 4T1乳腺癌细胞,使用台盼蓝拒染法检测细胞活力 >95%后,制备细胞浓度为 1×107个 /ml 的细胞悬液。模型组小鼠左侧腹部注射 0.1 ml 细胞悬液,同时对照组小鼠左侧腹部注射 0.1 ml 生理盐水。约 1 周后即可形成约 5 mm×5 mm 肿块,取部分肿块组织进行苏木精 -伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色,镜下观察是否为肿瘤细胞。

1.2.3实验动物给药

成瘤后第 1 天,中药组、化疗组小鼠按 6.28 mg/kg 的标准腹腔注射多西他赛(用注射用生理盐水定容至 0.1 ml),1 次 /7 d,持续 21 d;模型组、对照组小鼠腹腔注射 0.1 ml 生理盐水,1 次 /
7 d,持续 21 d。首次注射化疗药物的次日,中药组给予 0.3 ml 薯蓣丸汤剂灌胃,其他组予以 0.3 ml 生理盐水灌胃,1 次 /d,持续 21 d。

1.2.4实验动物处死及组织取样

治疗完成后当晚小鼠禁食、未禁饮 1 d。第 2 天将小鼠置于超净工作台颈椎脱臼处死,用无菌术器械取出小鼠脾脏,迅速置于 3 ml 缓冲液(PBS 和 1% 胎牛血清混合液)中,于 60 mm 培养皿中轻研脾脏,研磨完毕后移去细胞筛,将混合液移入 15 ml 离心管中,置于冰上,配平后 4℃、1 500 r/min 离心 5 min,去上清液。每管中加入 1ml 红细胞裂解液,静置 5 min,加缓冲液至 15 ml,4℃、1 500 r/min 离心 5 min,去上清液。加入 1000μl缓冲液混悬,分为 2 管,各 100μl,标记为 A、B,每管 1×105~ 1×108个细胞,备用。

1.2.5流式细胞术

将 CD4、CD8、CD25 细胞表面分子进行染色,固定、破膜后染色细胞内 Foxp3 分子。每列样本均设 A、B 管,分别吸取收集好的淋巴细胞悬液 100μl 放入 A、B 管,每管分别加入 0.500μlCD4 FITC、2.500μl CD8 PerCP、0.625μl CD25 APC,室温静置 20 min,加入冷 PBS 2ml 混匀,1 500 r/min离心 5 min,弃上清液。在 A、B 管中分别加入配好的固定液 1 ml,边加边混匀,室温静置 30 min。不需润
洗,每管加入 2 ml 配好的缓冲液,1 500 r/min,5 min,弃上清。每管加入100μl缓冲液混悬,分别加入1.25μlFox P3PE 单抗及同型对照,室温静置 20 min,加入2 ml 缓冲液润洗后,1 500 r/min,5min,弃上清。每管用500μl缓冲液混悬细胞,吹打混匀,置流式管中,4℃避光保存,待测。

1.3 统计学方法

数据分析采用 SPSS 20.0 统计软件,计量资料以均数 ± 标准差(x±s)表示,比较用方差分析,两两比较用 LSD- t 检验, P <0.05 为差异有统计学意义。

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