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单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法

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致你i 2021-12-21 08:38 评论( 0 ) 浏览( 228 )

1.细菌培养
该菌营养要求不高,兼性厌氧,最适在含有CO2的微需氧环境中生长,生长温度范围—1.5℃-45℃,最适温度为30℃-37℃,能在普通冰箱冷藏室生长,是一种典型的耐冷性细菌,同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。
食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌,以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAM P)等免疫学检测,被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括:冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30d ,有时甚至长达一年。常温增菌需培养24h 至7d 。故传统检测方法需要7-11d 才能分离鉴定出李斯特氏菌,故传统方法检测周期较长。
2.血清凝集法
根据菌体抗原和鞭毛抗原,LM分为16个血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原结构与毒力无关,对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b,占全球本病病例约90%。
3.分子生物学检测方法
随着核酸探针杂交技术的应用,使对单核细胞增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平。
3 .1  探针检测技术
这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子生物学技术。早在1988年,Atin 等就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一个500bp DNA 片断并测序,以此序列合成4种寡核苷酸探针,以32P 标记该探针,经斑点杂交实验证实,该探针只与李斯特氏菌反应,与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴性,表现出很好的特异性。但探针杂交无法分辨死菌和活菌,尽管通过增菌可使死菌比例减少,相对地减少假阳性,但并不能完全杜绝假阳性结果。随着探针技术的逐渐成熟,人们开始关注将多个DNA 特异性探针固定到芯片上,制成基因芯片。基因芯片的特点是可同时检测多种菌,可以减少实验次数,并且检测所需的引物较少。
3.2 聚合酶链式反应(poly merase chain reaction ,PCR)检测技术
PCR 的发展已经相当成熟,广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR 扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计,一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hly A 、iap 、inl 、Dth-18等毒力基因。利用PCR 方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好,不足之处是灵敏度较低;将样品培养物经化学抽提后再进行扩增,提高了样品的检出率;并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR 技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。例如Nogva 等运用5′-核酸酶PCR 对单增李斯特氏菌定量;Choia 等运用cPCR 对李斯特氏菌进行定量;Long 等以hly 为靶基因,采用PCRELISA联合检测技术。

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