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miRNA的加尾法逆转录和qPCR

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Pink 2022-02-24 09:55 评论( 0 ) 浏览( 474 )
一般来讲,mRNA比较长,其长度通常在几百至几千个核苷酸,因此使用随机引物(Random Primer p(dN)6)即可随机结合到mRNA的各位置进行逆转录。由于qPCR的过程只需扩增目的片段的一部分(80~200 bp),因此使用随机引物的逆转录产物尽管不完整,也完全能够满足qPCR的需求。当然,也可以使用Oligo dT引物统一从mRNA的ployA尾巴开始逆转录。这种逆转录引物在扩增cDNA全长时是必须的,但要注意,原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾,因此不能使用Oligo dT引物进行逆转录。 但miRNA与mRNA不同,成熟的miRNA的长度只有20nt左右,非常短,通常正向引物就足以覆盖其全长甚至有余,反向引物就无处安放了。那么如何实现miRNA的qPCR扩增呢?解决方案就是在逆转录的时候设法增加逆转录产物长度。普遍的方法有两种,加尾法和茎环法。经过加尾法或茎环法这种特殊的逆转录形式处理之后,得到的cDNA长度从原始的20nt增加到80nt以上,这样就能够实现miRNA的qPCR扩增了。 增加miRNA逆转录产物长度最直接的方法就是增加miRNA的长度,即在miRNA的3端后面添加一段序列,然后进行逆转录反应。因此,加尾法是由两个酶共同作用完成的,它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾,增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上,由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。 加尾法逆转录的最大特点在于:对于抽提纯化的miRNA,进行无差别加尾。因此,如果需要对样本中的多个miRNA进行考察,一次逆转录即可完成对所有qPCR模板的制备。qPCR引物方面,miRNA以及内参的反向引物都是通用引物R,不同的只是正向引物。因此在设计加尾法miRNA的qPCR引物时,只需设计特异性正向引物即可,正向引物的特异性直接决定了实验结果的好坏。总之,加尾法适合对样本中多个miRNA的快速检测。引物设计简单,但有非特异性的风险。
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