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蛋白质的鉴定与分析

Pink-会员头像-www.bncc.org.cn北纳生物
Pink 2022-03-07 09:15 评论( 0 ) 浏览( 272 )
从复杂混合物中纯化目标蛋白的方法很多,但制备层析纯化最常用。层析类型的选用取决于目标蛋白的理化特性。依据制备或定量分析,选用快速蛋白液相层析或高效液相层析。还可以选择下列层析或其组合:疏水作用柱层析,离子交换柱层析、分子棑阻层析及亲和层析。 如果仅需少量目标蛋白,可采用电泳技术。已知蛋白分子量,就可在电泳胶的相应位置,切割蛋白条带用于下一步质谱分析。通常 SDS-PAGE提供蛋白分子大小信息。如将等电聚焦胶条上样于SDS-PAGE,则是二维电泳,它提供蛋白质等电点和分子量信息。二维胶条的分辨率比一维胶条大大提高。 假如目标蛋白含量太少,可使用特异性抗体进行免疫印迹。抗体还可用于分离纯化蛋白。由于抗体结合的专一性,大多数最终产品都可以利用目标蛋白的抗体加以纯化。利用能结合大多数抗体分子的蛋白A偶联的或蛋白G偶联的琼脂糖凝胶,几乎所有抗体通过几轮离心就得到少量纯品。酶联免疫吸附分析(ELISA)技术 是利用抗体的灵敏分析方法。无须纯化,ELISA可鉴别并定量目标蛋白。 如果抗体足够,还可通过免疫组织化学或免疫荧光标记对机体组织及细胞中的目标蛋白进行定位及原位含量测定。 除抗体外,还可使用适配器,即特异性结合靶蛋白的核酸大分子研究目标蛋白。可通过SELEX,即指数富集配基系统进化技术筛选获得。由于极易化学合成,适配器将来会取代抗体。 近年来,液质联用越来越广泛用于靶蛋白鉴定,但质谱仅局限于定性分析。代谢标记在实验室受控培养条件下可定量。借助痕量靶蛋白的序列信息,代谢标记技术已成为精确可靠的蛋白质分析方法。最近,通过二维样本的质谱数据集成像或图谱成像,质谱成像(也称成像质谱)已成为直接检测组织或细胞特定区域蛋白质的有效手段。该方法仅凭观察组织细胞,就能原位探测靶蛋白的有无。也可在复杂情况下快速准确地探测特定生物标志物分子的有无。
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