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细胞转染(需要构建质粒,转染试剂,流式细胞仪或者荧光显微镜)

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张宜路 2020-02-04 16:18 评论( 0 ) 浏览( 2365 )
细胞转染(需要构建质粒,转染试剂,流式细胞仪或者荧光显微镜) 转染,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想的细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。 需要指出的一点是,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。常用转染方法一、脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷,能与核酸的磷酸根通过静电作用,将 DNA 分子包裹入内,形成 DNA-脂质体复合物,也能被表面带负电的细胞膜吸附,再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前实验室最方便的转染方法之一,其转染率较高,优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性,所以转染时间一般不超过 24 小时。二、电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使 DNA 分子进入胞内,这种方法就是电穿孔转染法。当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议使用电穿孔法转染。一般情况下,高电场强度会杀死 50%-70% 的细胞。现在针对电穿孔转染会引起大量细胞死亡而开发出了一种电转保护剂,可以大大的降低细胞的死亡率,同时提高电穿孔转染效率。三、病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染,此法可以快速100%感染,检测成功率高。四、磷酸钙转染磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA 复合物的一种将 DNA 导入真核细胞的转染方法,磷酸钙被认为有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的 DNA 可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由 Graham 和 van der Ebb 使用,后由 Wigler 修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞,不但适用于短暂表达,也可生成稳定的转化产物常用转染方法操作步骤脂质体介导的贴壁细胞质粒转染过程一、实验材料:1、贴壁细胞(CHO 细胞或者 HEK293T 细胞);2、脂质体 LIPOFECTAMINE 2000(转染试剂);3、6 孔或 24 孔细胞培养版;4、无血清培养基 OPTI-MEM(Opti-MEM® I 减血清培养基是 EMEM 的改良型,其中使用了 HEPES 和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子。);5、待转染的质粒(无内毒素)。二、实验步骤1、转染前一天,以合适的细胞密度接种到 6 孔或 24 孔培养板上。转染时,细胞要达到90~95%的融合。2、按照如下比例配制溶液 1:100 μl 无血清培养基OPTI-MEM + 2-3 μl lipofectamine 2000 /孔;(室温静置5min)3、配制溶液 2:100 μl 无血清培养基 OPTI-MEM + 4 μg 质粒/孔,震荡混匀;4、将溶液 1 与溶液 2 混合均匀,室温静置 20 min。5、在 4 中静置的过程中,将细胞培养板中的细胞培养液更换成无血清培养基 OPTI-MEM(6 孔板 800 μl 每孔,24 孔板 200μl 每孔);6、静置 20 min 后,将 4 中的混合液逐滴加入到相应的孔中,然后轻轻摇晃培养板,轻轻混匀。在 37℃,5%的 CO2 中培养 5~6 小时。7、5~6 小时后,更换含有血清的全培养基,在 37℃,5%的 CO2 条件下培养 24~48 h,然后检测转染水平。8、如果做稳定转染,换全培养基培养后 24h,即可以 1:10 或更高的稀释比例(根据细胞的生长情况)接种到新的培养板,加抗生素进行筛选。脂质体转染注意事项:1. 细胞的状态细胞状态的好坏是影响转染效率的关键因素,为了达到最佳的转染效果,转染细胞一定要处于最佳的生长状态。一般情况下,转染的细胞不要超过 17 代或者不要小于 3 代,最好是重新复苏细胞后培养三代,然后用来转染最佳。2.细胞的密度转染前细胞的密度最好达到 90%左右,细胞太少,转染后细胞容易死,细胞太多,转染效率会下降;3. 转染时间转染后,使用无血清培养基培养 OPTI-MEM 最多 5~6 小时,5~6 小时以后必须更换新鲜培养液,因为长时间无血清培养基 OPTI-MEM 培养会对细胞产生毒性作用,导致细胞死亡;4. 质粒浓度转染的质粒浓度不能太低,质量不能太差,所以,用于转染的质粒在抽提时最好使用去除内毒素的试剂盒来抽提,抽提过程中预防污染。5. 检测时间根据不同的细胞,转染后基因表达的时间不同,如果仅仅是检测质粒表达情况,一般转染 24 小时即可。磷酸钙介导的转染过程一、实验材料1、待转染的质粒 DNA;2、处于指数生长阶段的转染细胞;3、转染试剂A 液:2 M CaCl2B 液:2×HBS(pH 7.05)配方:2×HBS (pH7.05):900 ml ddH2O 中加入 NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214g,Glucose 2.4 g 和 HEPES 10 g,调 pH 至 7.05,定容至 1 升,过滤(0.2 μm 滤膜)除菌后储存于 4℃备用。二、实验步骤1、转染前一天,根据需要将细胞以合适的密度铺于组织培养皿中,而后将细胞置于 37℃培养箱培养 24 h;2、当细胞密度达到 50%-70%时,即可转染。转染前两个小时,给细胞更换新鲜培养液;3、制备磷酸钙-DNA 沉淀颗粒以 100 mm 培养皿转染体系为例。A 液:99 μl A 液+适量 DNA+ddH2O 至 750 μl;B 液:750 μl B 液。然后将 B 液缓慢逐滴加入到 A 液中,加入的过程中轻轻震荡,使加入的 B 液能够及时充分的与 A 液混合。A 与 B 混匀后,灯光下可以看到白色磷酸钙沉淀,然后将混合液室温静置 10-15 min;3、静置 10-15 min 后,将混合液逐滴加入到 100 mm 培养皿中,然后轻轻摇晃培养皿,使其充分混匀;4、将细胞置于 37℃培养箱培养 5-6 h,然后更换新鲜培养液;5、24 h 后收集细胞检测转染效率,如果是用来包装病毒,则需要更换配液培养一定时间后收集病毒即可。磷酸钙转染注意事项:1、细胞密度磷酸钙转染跟脂质体转染不同,不是细胞密度越大越好,最好将细胞密度保持在50%-70%的范围内,细胞过多或者过低都会影响转染效率;2、转染试剂的配置转染试剂配制的过程中,一定是将 B 液缓缓加入到 A 液中,顺序不能颠倒,加入过程中一定要震荡混匀,否则会形成大的沉淀颗粒,影响转染效率;3、充分混匀转染完成后可以轻轻晃动使其进一步混匀,但是摇晃不宜过剧烈,摇晃太剧烈会导致细胞漂浮;4、更换培液转染后培养 5-6 小时,一定要更换新鲜配液,配液最好是预热的,否则会影响转染后的细胞生长状态。转染效率的检测根据实验的目的不同,对于转染后转染效率的检测一般有以下几种常用的方法:一、实时定量 PCR 检测实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在 DNA 扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析的方法。Real-time PCR 是在 PCR 扩增过程中,通过荧光信号,对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期,模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。但是,荧光定量 PCR 所检测的是转染后细胞中待测基因的 mRNA 的表达水平,对于目的基因的蛋白表达水平不能够检测;二、Wester Blot 检测Western Blot 又称蛋白质免疫印迹(免疫印迹实验),其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或者生物组织样品进行着色,并通过分析着色的位置和着色的深度获得特定蛋白在所分析的细胞或者组织中表达情况的信息。Western Blot 所检测的是组织或者细胞中蛋白质的表达水平。三、流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对细胞或者其他生物粒子进行定量检测和分析的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中检测得到多个参数,与传统检测方法相比具有更加快速、准确以及定量等特点。使用流式细胞术检测转染效率可以更加精确的确定转染的效率,对转染效率进行量化。四、荧光显微镜观察当我们转染的质粒 DNA 含有荧光蛋白基因是,可以通过荧光显微镜观察的方法来确定转染的效率,在荧光显微镜下,可以观察到荧光的强弱以及荧光的效率。
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