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细胞迁移实验技术 —划痕实验

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张宜路 2020-02-05 10:35 评论( 0 ) 浏览( 1241 )
细胞迁移实验技术
 —划痕实验
细胞迁移划痕实验基本原理
细胞划痕(修复)法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法,类似体外伤口愈合模
型,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央
区域划线,去除中央部分的细胞,然后再继续培养细胞至实验设定的时间,然后取出细胞培
养板,观察周边细胞是否生长(修复)至中央划痕区,以此判断细胞的生长迁移能力,实验
通常需设定正常对照组和实验组,实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别,
通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力,可以判断各组细胞的迁移与修复能力
实验材料
1、细胞培养平板,一般使用 6 孔板,大小合适,便于划线和观察;
2、marker 笔,用于观察是标记;
3、直尺,用于观察时对细胞划痕宽度测量;
4、20 微升枪头(灭菌)或者经过灭菌处理的牙签均可,用于在单层细胞上划痕;
5、无血清培养基
6、PBS 
实验步骤:
1、培养板划线
首先使用 marker 笔在 6 孔板背后,用直尺比着,均匀的划横线,大约每隔 0.5~1cm 一
道,横穿过孔。每孔至少穿过 5 条线。划线时注意线不要太粗 
2、铺细胞
在孔中加入约 5×105 个细胞(不同的细胞数量有所不同,根据细胞的生长快慢调整),
接种原则为过夜后融合率达到 100%。
3、细胞划线
第二天用枪头或者无菌牙签,垂直与细胞平面,沿着投一天划在平板背面的线在细胞
层上进行划痕(不同孔之间最好使用同一只枪头或牙签)。
4、洗细胞
划痕完成后,使用无菌 PBS 洗细胞 3 次,洗去不贴壁的细胞,即划线时划线的细胞,
是划线后留下的间隙清晰可见,然后更换新鲜无血清培养基。
5、细胞培养、观察
将细胞放入 37℃ 5% CO2培养箱,培养。然后在适当的时间点,如 0,6,12,24h 取
出细胞,显微镜线观察并测量划痕的宽度,并拍照(具体时间依实验需要而定)。
6、结果分析
使用 Image J 软件打开图片后,随机划取 6 至 8 条水平线,计算细胞间距离的均值。
主要事项:
 1、铺细胞最好使用 6 孔板,因为 6 空板可以保证有相当距离的平直划痕,而且因为有
5 条定位线,与划痕相交,这样就有 10 个可固定监测点,不作重复,误差也很小。
2、如果你连续监测 24 小时,你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的
结果,而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移,你可以先用丝裂霉素(1 
μg/ml)处理一小时,抑制细胞的分裂,这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外,使用
无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。
3、照片拍完之后,可以用 image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
4、虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响,但是由于细胞内信号传导系统整体性的
下调节,细胞迁移的速度也会慢很多。
划痕法测量迁移的不足之处:
 1、适用的细胞范围小,一般只能适用于上皮细胞、纤维样细胞
划痕法的不足也很明显,适用的细胞系很窄,一般只能用于上皮,纤维样细胞系。因为:(1)
这些细胞本身有迁移能力,且较强;(2)细胞有极性,方便测量,观察;(3)细胞对无血清
有较强的忍受力(至少 24 小时),因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的。
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