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肿瘤干细胞—成球实验

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张宜路 2020-02-06 15:29 评论( 1 ) 浏览( 7193 )

肿瘤干细胞是存在于肿瘤当中的一小群具有无限增殖、可自我更新和分化、高致瘤和耐药等特征的干样细胞亚群。成球试验则是判断单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力,可以很好地用来鉴定细胞的干性,一般用细胞球形成效率(Sphere Formation Efficiency,SFE)表示。

对于某些肿瘤如胶质瘤和乳腺癌,它们的肿瘤干细胞在体外条件培养时相对较容易形成细胞球,而另一些上皮肿瘤如肝癌、结肠癌等则相对成球困难些。


前期准备:

培养基配置:无血清悬浮培养基(SFM):DMEM/F12基础培养基+ 1×谷氨酰胺+ 1×丙酮酸钠盐+ 20 ng/ml EGF + 10 ng/ml bFGF + 2% B27(v/v)+ 1%青/链双抗(v/v)(无血清,双抗可不加)(bFGF有文献参考用量20 ng/ml)


实验步骤:

(1)收集对数生长期细胞,PBS清洗2次,除去旧培养基;


(2)用无血清悬浮培养基重悬细胞,以500/孔、1000/孔、2500/孔接种于低粘附的24孔板中,连续培养7天,观察细胞团生长情况;

注:具体的细胞密度会因细胞株的不用有所差异,大家需要提前查阅文献合理设计;一般种板后3d后会有少量细胞球出现,7d会形成体积较大且致密的细胞球。下面展示的是种板密度为1000个/孔的结直肠癌细胞株DLD-1成球培养7天时的结果。


(3)7d后收集形成的细胞球于15ml离心管中,1000r,5min离心去上清,加入1ml胰酶消化5min(孵箱孵育,时间可适当延长),打散制备单细胞悬液,离心去胰酶,5ml PBS清洗2次后SFM培养基重悬,计数并以适当密度接种于低粘附的24孔板中;

(4)1周后观察细胞成球情况

(5)2次低粘度培养皿培养后细胞可培养至普通培养皿中,细胞会少量贴壁,但形态不变,可适当吹打。

注:实验要经过成球-消化制备单细胞-成球4个周期,最后一次得到的细胞球可认为是具有自我更新能力的肿瘤细胞。


注实验中得到的细胞团可能不是致密的球状或者聚集在了一起,前者可能是因为细胞差异,其实只要是一个单独的细胞形成的细胞团我们就可以认为这群细胞是我们想要的有干性特征的细胞;若是细胞团聚集在了一起那可能是细胞密度太大所致,适当降低密度就可以了


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  • 用这个方法 干细胞成球 会聚在一起吗? 我用F12 培养基+血清 在ula 板培养肝细胞A549. 一两天后就聚成一团了。 这样就没办法数细胞了。 请问这要怎么改近呢?
    2020-11-05
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