北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

检测噬菌体对金黄色葡萄球菌的清除效果(一)

发布时间:2021-10-21 16:24 作者:北纳生物编辑-陈丹

近年来,噬菌体作为一种天然的抗菌剂备受关注,在食品安全领域的应用也越来越多,如利用噬菌体清除奶酪中的金黄色葡萄球菌;利用噬菌体鸡尾酒降低牛奶、鸡胸肉和白菜中沙门氏菌(Salmonella)浓度;利用噬菌体抑制生鱼片组织表面单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的生长,防止生鱼片腐败;利用噬菌体鸡尾酒降低蔬菜和牛肉中大肠杆菌(Escherichia coli)浓度,延长贮存时间等。目前,美国食品药品监督管理局已经批准了几种用于食品上市前预防细菌污染的噬菌体制剂。由此可见,噬菌体在作为食品生物抗菌剂方面具有巨大的发展潜力。

本实验以金黄色葡萄球菌ATCC 43300为宿主菌,分离裂解性噬菌体,研究其生物学特性,检测该噬菌体对细菌及生物被膜的清除效果,并评估噬菌体在巴氏灭菌的脱脂牛奶和全脂牛奶中抑菌潜力,旨在探讨噬菌体作为乳制品生产、加工过程中生物抗菌剂的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

金黄色葡萄球菌ATCC 43300由吉林大学顾敬敏教授馈赠;金黄色葡萄球菌Sau254分离自鲜牛乳,经鉴定为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;污水样品采自黑龙江省某养牛场。SM缓冲液、磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsaline,PBS) 生工生物工程(上海)股份有限公司;Luria-Bertani(LB)培养液、琼脂 青岛海博生物技术有限公司;24 孔细胞爬片、结晶紫、二苯甲亚胺、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、聚乙二醇辛基苯基醚和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸 北京索莱宝科技有限公司;96 孔细胞培养板、24 孔细胞培养板无锡耐思生物科技有限公司;巴氏灭菌牛奶、304型不锈钢片为市售。

1.2 仪器与设备

DRP-9082电热恒温培养箱 上海森信实验仪器有限公司;5810R高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司;T6分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Ti2荧光显微镜 日本尼康公司;JEM-2100 Plus透射电子显微镜 日本电子株式会社。

采集养牛场污水500 mL,参照Jamalludeen等的方法分离噬菌体。污水用滤纸过滤后,5 000×g离心15 min,除去污水中杂质,使用0.45 μm的半透膜对水样进行浓缩,54 2021, Vol.42, No.01 食品科学 ※基础研究最后用0.22 μm滤膜过滤除菌。将100 mL 2×LB培养液和1 mL培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌ATCC 43300菌液加入处理后的污水中,37 ℃振荡培养过夜,次日采用双层平板法对分离到的噬菌体进行纯化。将纯化后的噬菌体用SM缓冲液10 倍连续稀释,每个稀释度取100 μL稀释液加入100 μL宿主菌中制成双层平板,按下式计算噬菌体效价。

计算公式|北纳生物

式中:噬菌斑数为3 组重复实验的每个平板上噬菌斑数量的平均数/PFU;稀释倍数为经过10 倍连续稀释后最终的稀释倍数;0.1为最初取液量(100 μL)。采用磷钨酸负染色法观察噬菌体形态,将20 μL噬菌体悬液(106 PFU/mL)滴于铜网,吸附15 min后取出铜网,自然干燥2~3 min,用体积分数2%磷钨酸水溶液染色,2 min后吸干水分,自然干燥10 min,透射电子显微镜观察噬菌体形态。

1.3.2 噬菌体的生物学特性分析

1.3.2.1 最佳感染复数的测定

最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)参照Lu等[15]的测定方法,略有改动。按照不同感染比例(1∶1 000、1∶100、1∶10、1∶1、10∶1、100∶1)(噬菌体数∶细菌数)将噬菌体和对数生长期的宿主菌混合,37 ℃振荡培养(160 r/min),3.5 h后测定上清液中噬菌体效价,效价最高的比例即为MOI。

1.3.2.2 一步生长曲线的绘制

一步生长曲线可以反映噬菌体从吸附宿主菌到释放子代噬菌体的完整增殖周期。将噬菌体和对数生长期的宿主菌以MOI=1∶100混合,37 ℃静置培养15 min后12 000×g离心,弃上清液,使用50 mL预热的LB培养液重悬细菌细胞沉淀,迅速置于37 ℃摇床中振荡培养(160 r/min)。分别于不同时间测定培养液中噬菌体效价。以取样时间为横坐标,噬菌体效价为纵坐标,绘制一步生长曲线。

1.3.2.3 pH值稳定性实验

取1 mL效价约为108 PFU/mL的噬菌体于试管中,分别加入1 mL pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM缓冲液,室温作用1 h,稀释适当倍数并通过双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.2.4 热稳定性实验

取1 mL效价约为108 PFU/mL的噬菌体于试管中,分别在20、30、40、50、60、70 ℃水浴作用1 h,稀释适当倍数并通过双层平板法测定噬菌体效价。

1.3.3 噬菌体对乳源金黄色葡萄球菌的清除作用

1.3.3.1 噬菌体对金黄色葡萄球菌Sau254的裂解作用

将Sau254菌株培养至对数生长期,PBS洗涤去除培养基,并调整细菌浓度为1010 PFU/mL,加入1 mL效价约为107 PFU/mL的噬菌体于37 ℃静置培养,分别于0、1、2、4、6、8、12、24 h测定培养液中细菌浓度以及噬菌体效价。

1.3.3.2 噬菌体对生物被膜的清除效果

参照Torlak等[17]的方法,在96 孔板上培养成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜,用PBS洗涤3 次去除浮游菌和培养基,之后加入200 μL效价约为107 PFU/mL的噬菌体溶液,分别于0、4、8、12、24、48 h通过稀释平板涂布法测定生物被膜内细菌数量,并通过结晶紫染色法确定噬菌体对细菌生物被膜清除效果。将噬菌体处理后的生物被膜样品用PBS缓慢清洗3 次,去除浮游细菌和培养基,之后每孔加入200 μL体积分数95%的甲醇溶液,室温固定30 min,再用PBS冲洗3 次,自然晾干后每孔加入0.1%的结晶紫溶液染色30 min,流水冲洗每孔2~3 次,最后每孔加入200 μL体积分数30%冰乙酸作用15 min,使用分光光度计测定OD600 nm,记录数据。

1.3.3.3 荧光显微镜观察

按1.3.3.2节的方法,在24 孔细胞爬片上培养成熟的细菌生物被膜,加入2 mL效价约为107 PFU/mL的噬菌体溶液,分别处理0、24、48 h,PBS洗涤3 次去除游离细菌,之后使用二苯甲亚胺染色3~5 min,封片后置于荧光显微镜下观察膜内细菌密度,以0 h未经噬菌体处理的生物被膜作为对照组,分析噬菌体对生物被膜的清除效果。

1.3.4 噬菌体在牛奶中的抑菌应用

将Sau254菌株培养至对数生长期,PBS洗涤去除培养基,分别使用脱脂牛奶和全脂牛奶将细菌终浓度稀释为1×104 CFU/mL,设立实验组和对照组。实验组加入1 mL效价约为107 PFU/mL的噬菌体,对照组加入等体积的PBS,分别置于4 ℃和25 ℃中静置培养,分别于0、4、8、12、24 h测定脱脂和全脂牛奶中细菌浓度以及噬菌体效价。

1.3.5 噬菌体对不锈钢材料上生物被膜的清除作用

参照邓旗等的方法,略有改动。将不锈钢片用NaOH和丙酮处理后,移入培养液中,按1.3.3.2节的方法培养生物被膜。之后加入2 mL效价约为107 PFU/mL的噬菌体溶液,分别于0、4、8、12、24、48、72 h测定生物被膜内细菌数量和上清液中噬菌体效价。

1.3.6 常用洗涤剂对噬菌体活性的影响

取效价约为108 PFU/mL的噬菌体分别与SM缓冲液、阴离子洗涤剂(1%(质量分数,下同)十二烷基硫酸钠)、阳离子洗涤剂(1%十六烷基三甲基溴化铵)、非离子洗涤剂(1%聚乙二醇辛基苯基醚)和两性离子洗涤剂(1% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸)等体积混合,37 ℃作用30 min,通过双层平板法测定各组洗涤剂中噬菌体效价,以SM缓冲液作为对照组,评价各种洗涤剂对噬菌体活性的影响。

1.4 数据处理与分析

实验结果以平均值±标准偏差表示,数据采用GraphPad Prism 8统计学软件进行分析。两组间比较采用student t检验,以P<0.05表示有统计学意义。

相关链接:金黄色葡萄球沙门氏菌大肠杆菌,噬菌体,二苯甲亚胺结晶紫北纳生物

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