北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

检测噬菌体对金黄色葡萄球菌的清除效果(二)

发布时间:2021-10-21 16:26 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 噬菌体的形态观察结果

从养牛场采集的污水中分离出一株噬菌体,其噬菌斑呈现出典型裂解性噬菌体特征,透亮且有晕环,直径为1.5~2.0 mm,双层平板法测定噬菌体效价为1×108 PFU/mL。

2.2 噬菌体透射电子显微镜观察结果

图 1 噬菌体透射电子显微镜图(30 000×)

 噬菌体透射电子显微镜图|北纳生物

如图1所示,噬菌体头部呈正多面体,头部直径(83.0±0.5)nm,尾部长度(140±1)nm,其尾部可收缩,按国际病毒分类委员会分类规则,符合肌尾噬菌体科特征,因此命名为vB_SauM_RS。

2.3 噬菌体最佳感染复数和一步生长曲线分析结果

当MOI=1∶100时噬菌体产出量最高,因此,按1∶100的比例绘制一步生长曲线。由图3B可知,噬菌体vB_SauM_RS在感染宿主细菌后的20 min内效价几乎保持不变,表明该噬菌体潜伏期约为20 min,在感染宿主细菌后20~50 min,噬菌体效价急剧增加,可知vB_SauM_RS爆发期约为30 min,噬菌体的平均裂解量为39 PFU/cell(裂解量=爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度)。

2.4 噬菌体pH值稳定性

图 2 噬菌体vB_SauM_RS pH值稳定性

噬菌体vB_SauM_RS pH值稳定性|北纳生物

由图2可知,vB_SauM_RS在pH 4.0~11.0时效价与初始效价(约108 PFU/mL)无明显差异,且具有良好的裂解活性,说明该噬菌体对酸碱的耐受力较强;当pH值低于4.0或者高于11.0时噬菌体基本失活,说明vB_SauM_RS的稳定pH值范围为pH 4.0~11.0。

2.5 噬菌体热稳定性

vB_SauM_RS在20~50 ℃内活性保持稳定,60 ℃时噬菌体效价降低至初始效价的50%以下,在高温(70 ℃)时全部失活。因此,vB_SauM_RS对高温耐受性较差,适合在50 ℃及以下温度生存。

2.6 噬菌体对金黄色葡萄球菌Sau254的裂解作用

vB_SauM_RS作用24 h后,细菌浓度由1×1010 CFU/mL降至0 CFU/mL,而vB_SauM_RS效价从105 PFU/mL增至108 PFU/mL。Sau254浓度随vB_SauM_RS作用时间延长不断降低,vB_SauM_RS效价不断增加,表明vB_SauM_RS能够持续有效抑制和清除细菌。噬菌体效价在8 h升至108 PFU/mL后趋于稳定,表明vB_SauM_RS增殖具有自我限制。

2.7 噬菌体对生物被膜的清除效果

噬菌体vB_SauM_RS对生物被膜的清除效果|北纳生物

图 3 噬菌体vB_SauM_RS对生物被膜的清除效果

由 图 3 可知,成熟的生物被膜内细菌浓度为5.28(lg(CFU/mL)),随着vB_SauM_RS处理时间的延长被膜内细菌浓度不断减少,作用4 h后细菌浓度下降至4.97(lg(CFU/mL)),作用12 h被膜内细菌浓度下降至4.48(lg(CFU/mL)),作用48 h后细菌浓度下降至3.94(lg(CFU/mL))(生物被膜内细菌浓度降低了95.6%),表明vB_SauM_RS对生物被膜有良好的清除效果;结晶紫染色结果显示,噬菌体处理48 h后,OD600 nm由0.83降至0.36,同样表明vB_SauM_RS对生物被膜具有良好的清除效果。

2.8 荧光显微镜观察结果

Sau254菌株可在细胞爬片上形成致密的生物被膜结构。与对照组相比,vB_SauM_RS处理24 h和48 h后细菌呈分散分布,少有聚集的现象,且被膜内细菌密度明显减小,表明vB_SauM_RS可以破坏生物被膜结构并且对膜内细菌有较强的清除能力。

2.9 噬菌体在牛奶中的抑菌作用结果

在4 ℃条件下,脱脂牛奶中加入vB_SauM_RS作用4 h时,噬菌体与细菌的浓度均升高,但在8 h时实验组与对照组Sau254浓度出现不同的变化。当作用24 h时,实验组Sau254浓度较对照组下降了1.079(lg(CFU/mL));在4 ℃条件下,全脂牛奶中加入vB_SauM_RS前12 h实验组和对照组Sau254浓度均升高,没有出现明显的差异,但在作用24 h时,实验组Sau254浓度较对照组下降了1.021(lg(CFU/mL));在25 ℃条件下,于脱脂牛奶和全脂牛奶中分别加入vB_SauM_RS作用24 h后,实验组Sau254浓度较对照组分别下降了5.418(lg(CFU/mL))和5.740(lg(CFU/mL))。

结果表明,vB_SauM_RS在脱脂和全脂牛奶中对Sau254均具有良好的抑制作用,并且对低温保存牛奶中Sau254同样具有抑制作用。实验组中vB_SauM_RS效价从初始5×106 PFU/mL升至108 PFU/mL,表明vB_SauM_RS能利用宿主菌进行自我增殖,不断扩大优势,最终抑制细菌生长。并且噬菌体效价会维持在较高的水平,产生持续的抑菌作用。

2.10 噬菌体对不锈钢板材料上生物被膜的清除作用

生物被膜的清除作用|北纳生物

图 4 噬菌体vB_SauM_RS对不锈钢片表面生物被膜的清除作用

由图4可知,vB_SauM_RS对不锈钢上生物被膜的清除效果明显,作用72 h后Sau254浓度由初始6.8×104 CFU/mL降至3.5×102 CFU/mL,被膜内细菌数量降低了99.5%,具有明显的清除效果。噬菌体效价由107 PFU/mL升至108 PFU/mL,结果表明其能够对生物被膜保持持续的清除作用。

3 讨 论

与传统的抗菌剂相比,噬菌体作为一种天然的抗菌剂具有先天优势,在自然界广泛分布、对正常菌群无影响、有长期使用史。目前许多研究机构致力于噬菌体制剂的研发,以期减少细菌污染问题。牛奶和乳制品在贮存、运输和加工过程中极易被细菌污染,严重影响牛乳品质,其中金黄色葡萄球菌污染较为常见。因此,研究噬菌体对牛奶中金黄色葡萄球菌的防控和对乳制品行业的发展具有重要的意义。本实验分离的噬菌体vB_SauM_RS属于有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科。该噬菌体潜伏期20 min,在50 ℃以下、pH 4.0~11.0范围内活性稳定,具有良好的环境耐受能力。vB_SauM_RS在适宜条件下24 h可完全清除浓度为1×1010 CFU/mL的金黄色葡萄球菌,具有高效的裂解效率。

本实验不同材料表面生物被膜的清除效果结果表明,vB_SauM_RS对聚苯乙烯、玻璃、不锈钢表面生物被膜均具有良好的清除效果,可明显降低膜内细菌数量。实验中细菌生物被膜虽然没有被完全清除,但vB_SauM_RS可以破坏生物被膜的完整性,使其更容易被清除,并且噬菌体效价最终维持在108 PFU/mL,能够持续抑制生物被膜形成。因此,应用vB_SauM_RS预防和控制乳制品生产加工过程中细菌生物被膜是切实可行的。此外,噬菌体应用于实际生产时不可避免地会与洗涤剂发生接触,本实验研究发现,阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠和阳离子洗涤剂十六烷基三甲基溴化铵可显著降低噬菌活性,应用时应避免与此类洗涤剂共同使用。

综上,本实验所分离的噬菌体vB_SauM_RS具有作为生物抗菌剂的潜力,不仅对牛奶中金黄色葡萄球菌有良好的裂解效果,对生物被膜也有很好的清除作用,但在应用时应避免与阴离子或阳离子洗涤剂共同使用。

相关链接:金黄色葡萄球菌,生物被膜,菌株,十六烷基三甲基溴化铵,肌尾噬菌体科,北纳生物

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