北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

探究植物乳杆菌对原肌球蛋白免疫活性的影响(一)

发布时间:2021-10-22 16:25 作者:北纳生物编辑-陈丹

原肌球蛋白(tropomyosin,TM)是甲壳类和贝类的主要过敏原,它是一种酸性糖蛋白,分子质量约为35~38 kDa,由2 个相同的α-螺旋结构的亚基相互缠绕构成超螺旋结构,包含7 个交互的肌动蛋白结合位点,结构稳定且耐高温。乳酸菌是人体肠道中必不可少的一种有益于身体健康的细菌,且大量存在于人体内。研究发现,乳酸菌可以解离食物中的蛋白质、糖分以及合成维生素等,从而达到提高食物消化率和生物价,促进人体对食物消化吸收的目的。Frias等利用瑞士乳杆菌、枯草芽孢杆菌、米根霉和酿酒酵母混合菌种发酵大豆蛋白,发现发酵后的大豆过敏原的致敏性显著降低。

高卿等选用木糖葡萄球菌发酵海鲈鱼,结果显示发酵60 h后小清蛋白的IgG结合能力下降26.9%,IgE结合能力下降22.3%。Bu Guanhao等在牛乳中分别接入L. helveticus和S. thermophilus 2 种乳酸菌,酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)实验结果表明α-乳白蛋白的致敏性在发酵后分别降低了71%和49%,当2 种菌混合发酵牛乳时,α-乳白蛋白的致敏性降低了87%。Jedrychowski等得到了一致的结论。

目前,国内外利用加热、辐照、美拉德反应、酶解等方法消减原肌球蛋白的免疫活性和致敏性的研究较多,然而利用乳酸菌消减过敏原原肌球蛋白的免疫活性和致敏性的报道很少。为探究植物乳杆菌L. plantarum对原肌球蛋白免疫活性的影响,解析植物乳杆菌消减TM免疫活性的作用位点,本研究利用植物乳杆菌的完整菌体、破碎菌体(破碎内容物、菌体碎片、胞内酶提取液)以及化学修饰菌体提取物(去除蛋白、去除脂肪、去脂磷壁酸、羧基酯化、氨基甲基化)分别水解TM,分析比较植物乳杆菌不同成分提取物对TM免疫活性的影响差异,然后利用表位多克隆抗体及红外光谱技术研究不同成分提取物对TM二级结构及其致敏表位的影响,探究TM免疫活性变化与结构及致敏表位变化的构效关系,为食物过敏原的活性控制及低致敏性水产加工制品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南美白对虾(Penaeus vannamei) 市购。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)由上海海洋大学分子生物学实验室提供;MRS培养基 青岛海博生物技术有限公司;BCA蛋白质测定试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;预染色和未染色的蛋白质标记物 立陶宛Fermentas公司;96 孔板 美国Corning公司;山羊抗小鼠IgG-HRP抗体 美国Invitrogen公司;N,N,N’,N’-四甲基二乙胺、DAB显色试剂盒 美国Sigma公司;0.22 μm PVDF膜 美国Millipore公司。针对甲壳类主要过敏原 T M 具有特异性反应的单克隆抗体 5G5E 及针对致敏表位 Epitope l(TKLAEASQAADESER)、Epitope 2(DEERM)、Epitope 3(FLAEEADRK)的多克隆抗体由本实验室自制。

1.2 仪器与设备

Mini protean 4蛋白质电泳仪 美国Bio-Rad公司;AE-8135半干式转膜仪 日本ATTO公司;powerlook2100XL-MSB凝胶扫描仪 美国MMAX公司;Synergy2多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;Z36HK高速冷冻离心机 德国Hermle公司;TS-8脱色摇床 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司;HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司;Spotlight 400傅里叶变换红外光谱仪英国PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 TM的提取和富集

参照孙佳益的方法,虾去头去壳去尾去虾线后,绞肉机搅碎并加入冷丙酮抽提至丙酮溶液为无色,将沉淀物风干并向其中加入含0.5 mmol/L DTT的磷酸盐-吐温缓冲液(phosphate buffered saline-tween,PBST),匀浆煮沸并离心35 min后向上清液中加入45%硫酸铵溶液,待硫酸铵全部溶解后离心35 min收集沉淀。将沉淀用PBS溶解并透析48 h,即得到富集纯化的TM。

1.3.2 TM纯度验证

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)根据Laemmli [13]的方法进行。分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为5%。将不同样品分别与2×上样缓冲液混合并煮沸后加8 μL到样品孔中,设置电源电压进行跑胶,电泳结束用考马斯亮蓝染色液染色,然后脱色至蛋白条带清晰。

1.3.3 植物乳杆菌不同成分提取物样品的制备

1.3.3.1 活菌体制备

将活化3 代后的植物乳杆菌液体培养至对数期末稳定期初,调整菌浓度使其含菌量在1×108CFU/mL以上,取1 mL菌液,离心(12 000 r/min,4 ℃,15 min)收集沉淀,无菌PBS清洗3 次后保存于4 ℃待用。

1.3.3.2 破碎内容物、菌体碎片和胞内酶提取液制备

破碎内容物制备:根据李秀明等的方法略有改动,向菌体中添加终质量浓度为1 mg/mL的溶菌酶并在30 ℃作用2 h,再用超声波细胞破碎仪以功率200 W,超声2 s、停2 s,超声5 min后即得到菌体的破碎内容物,4 ℃保存待用。菌体碎片和胞内酶提取液制备:将菌体的破碎内容物离心(12 000 r/min,4 ℃,15 min),收集的沉淀为菌体碎片,收集的上清液为胞内酶提取液,4 ℃保存待用。

1.3.3.3 去除蛋白、脂肪、脂磷壁酸样品制备

去除蛋白样品制备:根据Elnezami等的方法略有改动,将12 mg真空冷冻干燥的菌体溶解于1.2 mL10 mmol/L的磷酸钠缓冲溶液中(pH 7.6,含0.5 mg/mL蛋白酶), 3 7 ℃摇床中反应 2 h ,离心收集沉淀(12 000 r/min,4 ℃,15 min),无菌PBS清洗3 次后得到去除蛋白的菌体,4 ℃保存待用。去除脂肪样品制备:参考去除蛋白样品的制备方法,将含有蛋白酶的缓冲溶液替换为1.2 mL 10 mmol/L的磷酸钠缓冲溶液(pH 7.6,含0.5 mg/mL脂肪酶),其余操作不变,制得去除脂肪的菌体,4 ℃保存待用。去脂磷壁酸样品制备:参考郭春锋[16]的方法略有改动,将12 mg真空冷冻干燥的菌体溶解于1.2 mL正丁醇溶液,37 ℃摇床中反应2 h,离心(12 000 r/min,4 ℃,15 min)收集沉淀,无菌PBS清洗3 次后得到去除脂磷壁酸的菌体,4 ℃保存待用。

1.3.3.4 羧基酯化和氨基甲基化样品制备

羧基酯化样品制备:参考Ramrakhiani等[17]的方法略有改动,向真空冷冻干燥的菌体中加入1.2 mL甲醇-浓盐酸(108∶1,V/V)混合溶液,125 r/min室温反应6 h后,离心(12 000 r/min,4 ℃,15 min)收集沉淀,无菌PBS清洗3 次后得到羧基酯化的菌体,4 ℃保存待用。氨基甲基化样品制备:参考Chen Huimei等[18]的方法略有改动,向真空冷冻干燥的菌体中加入1.2 mL甲醛-甲酸(1∶2,V/V)混合溶液,之后参照羧基酯化样品的制备方法制备得到氨基甲基化的菌体,4 ℃保存待用。

1.3.4 植物乳杆菌不同成分提取物对TM免疫活性影响作用评价

1.3.4.1 植物乳杆菌不同成分提取物水解TM

将植物乳杆菌不同成分提取物分别接入质量浓度为2 mg/mL的TM溶液中,置于37 ℃摇床中(200 r/min)水解48 h,每隔12 h取一次样,以未加乳酸菌,但在同等条件下(37 ℃、200 r/min)放置48 h的TM溶液作为对照。离心(12 000 r/min,4 ℃,10 min)收集上清液进行免疫活性测定。

1.3.4.2 SDS-PAGE

参照1.3.2节方法进行。

1.3.4.3 蛋白免疫印迹

根据Song Yongna等的方法进行。根据SDS-PAGE法制得转移胶,180 mA、20 min条件下将胶上条带转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h后PBST洗膜3 次,每次5 min,然后用TM的特异性单抗5G5E(1 μg/mL)孵育1 h,洗涤后用HRP-羊抗小鼠IgG(1∶2 500)溶液孵育1 h,洗液洗涤,加入DAB工作液显色5 min后用去离子水洗去残留显色液并风干拍照。

1.4 数据处理

实验结果均采用 ±s表示,由Origin 2018 64Bit软件进行图形制作。

相关链接:植物乳杆菌,原肌球蛋白,瑞士乳杆菌枯草芽孢杆菌米根霉酿酒酵母北纳生物

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