北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

探究植物乳杆菌对原肌球蛋白免疫活性的影响(二)

发布时间:2021-10-22 16:26 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 TM的提取和富集

Lehrer等研究报道TM分子质量在32~38 kDa之间。对比各样品条带可以明显看到,相较于未经处理的提取液样品1,煮沸后的样品2和硫酸铵处理透析后的样品5位于35.0 kDa附近的条带很粗。由此可见,煮沸和硫酸铵处理可以有效富集南美白对虾中的TM蛋白质,富集后的提取液中TM含量较多,纯度较高,可以满足实验需求。

2.2 提取物对TM含量及免疫活性的影响

与TM对照样品(C)相比,经植物乳杆菌菌体及其不同成分提取物水解TM 12 h后,35 kDa附近条带均明显变窄变浅或消失,水解48 h的TM产物条带均肉眼不可见,由此可见TM含量明显减少,其中,部分产物与5G5E有2 个反应条带,其原因很可能是TM蛋白在植物乳杆菌的作用下发生部分水解造成的。与此相对应的,不同处理的植物乳杆菌水解TM后的产物与TM特异性单克隆抗体5G5E的免疫反应条带随着反应时间的延长明显减弱,免疫印迹结果显示这2 个条带均可与5G5E发生特异性反应,表明植物乳杆菌的水解虽然可破坏TM蛋白质的空间结构,但其抗原表位并未被完全破坏,因此水解产物仍会与5G5E抗体发生反应。

此外,SDS-PAGE和免疫印迹结果显示,菌体胞内酶及破碎内容物水解TM 24 h,TM条带几乎不可见,而菌体碎片水解TM 36 h,TM条带及其与5G5E抗体的免疫反应条带仍清晰可见,说明菌体胞内酶及破碎内容物的水解效果明显优于菌体碎片;去除菌体表面的蛋白质、脂肪、脂磷壁酸或将羧基酯化后,其12 h的水解产物条带与5G5E的结合能力无显著差异,表明这几种处理的植物乳杆菌对TM蛋白的水解能力无明显差别。

然而,菌体表面经氨基甲基化处理后,水解TM 24 h的产物依然存在与5G5E抗体的免疫反应条带,表明氨基甲基化后的菌体对TM免疫活性的消减能力明显减弱,这与SDS-PAGE结果一致。为进一步定量分析植物乳杆菌及其不同成分提取物对TM免疫活性的影响作用,本研究采用竞争性ELISA评价菌体及各提取物对TM免疫活性的降低程度。水解反应12 h后,菌体碎片和氨基甲基化菌体对免疫活性消减率最低,分别为21.1%和18.5%,其他成分提取物和菌体样品对TM免疫活性消减效果差别不大,消减率均在31.8%~37.1%之间;水解反应48 h后,菌体及其不同成分提取物对TM免疫活性的消减率均大于60%,其中菌体对免疫活性的消减效果最佳,达76.9%,菌体碎片及氨基甲基化菌体消减效果最差,消减率分别为60.7%和61.7%。消减率越高,TM的免疫活性越弱,说明该成分提取物对TM免疫活性的消减效果最佳,反之亦然。

由此可见,SDS-PAGE、蛋白免疫印迹和ELISA结果均显示,不同处理的植物乳杆菌对TM免疫活性的影响具有显著差异,将菌体破碎或将其氨基甲基化后,其对TM免疫活性的消减能力明显下降,其原因很可能是它们在水解TM的过程中,会不同程度地破坏TM蛋白的空间结构及其抗原表位。

2.3 植物乳杆菌不同成分提取物对TM二级结构的影响

蛋白质红外光谱酰胺I带(1 700~1 600 cm-1)的特征振动频率主要取决于其氨基酸残基的C=O和N—H之间的氢键性质,它可以反映多肽或蛋白质二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规卷曲等结构相对含量的信息(1 610~1 640 cm-1特征β-折叠;1 640~1 650 cm-1特征无规卷曲;1 650~1 658 c m -1特征α -螺旋;1 660~1 700 cm-1特征β-转角)。SDS-PAGE和免疫印迹结果显示植物乳杆菌的不同成分提取物对TM免疫活性的影响具有显著差异,其中破碎菌体和氨基甲基化后的菌体对TM免疫活性的消减能力明显减弱。为进一步解析植物乳杆菌对TM免疫活性的消减作用,采用红外光谱技术分析了植物乳杆菌不同成分提取物对TM二级结构的影响作用。

由图1可知,TM对照样品的α-螺旋相对含量最高,无规卷曲结构次之,分别为71.7%、15.2%,这与相关研究结果一致。研究发现,菌体水解TM后其α-螺旋相对含量最少,为15.4%,下降了56.3%,解旋率高于其他成分提取物,α-螺旋大部分解旋为β-折叠,β-折叠相对含量增加了26.2%。与之相反,菌体碎片和氨基甲基化菌体水解TM的产物,其α-螺旋相对含量分别为23.7%和21.2%,解旋率低于其他成分提取物,β-折叠相对含量分别为17%和19.2%,也明显低于其他成分的TM水解产物。

潘迪利用超高压协同转谷氨酞胺酶处理花生致敏蛋白Ara h 1,结果发现随着压力增加,Ara h 1的α-螺旋相对含量明显减少,β-折叠相对含量增多,Ara h 1二级结构的变化影响其致敏性。由此可见,植物乳杆菌会较大程度破坏TM的二级结构,大部分α-螺旋解旋为β-折叠,TM结构的进一步折叠化导致暴露的抗原表位被包埋,减少了与抗体结合的机会,从而降低了TM蛋白的免疫活性。而菌体碎片和氨基甲基化菌体对TM α-螺旋结构的破坏最小,且TM的折叠化结构较少,因而相较于其他成分提取物,增加了处理产物与免疫位点的特异性结合机会,表现为菌体碎片和氨基甲基化菌体对TM的免疫活性消减率最低。

植物乳杆菌北纳生物

图 1 植物乳杆菌不同成分提取物水解前后TM的二级结构相对含量

2.4 植物乳杆菌不同成分提取物对TM致敏表位的影响

本团队前期研究发现,TM经体外模拟胃液消化2 h后,其消化产物中存在3 个抗消化性能强的抗原表位Epitope l(TKLAEASQAADESER)、Epitope 2(DEERM)和Epitope 3(FLAEEADRK),这3 个抗原表位很可能是TM的关键致敏表位[26]。为进一步分析植物乳杆菌不同成分提取物对TM致敏表位的影响,以3 个合成表位与血蓝蛋白的偶联物作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备这3 种表位的多克隆抗体,通过间接ELISA分析植物乳杆菌不同成分提取物的TM水解产物与这3 个致敏表位间的特异性反应情况。将致敏表位的抗血清从100 倍梯度稀释至1 600 倍,ELISA结果显示随着小鼠血清稀释倍数的增加,小鼠血清与合成表位反应的OD值逐渐降低,表明这3 种致敏表位的多克隆抗体与Epitope 1、Epitope 2、Epitope 3具有特异性反应。

菌体水解TM后其产物与PAb-Epitope l、PAb-Epitope 2、PAb-Epitope 3的结合反应变化率均高于其他成分提取物的水解产物,分别下降了70.3%、30.7%、54.3%;菌体碎片与氨基甲基化菌体的水解产物与3 个表位抗体的结合反应变化率均明显低于其他成分提取物,其中与PAb-Epitope l的结合反应下降最为显著,分别为48.1%、46.1%,其次是与PAb-Epitope 3的结合反应(27.3%、23.9%),而与PAb-Epitope 2的结合反应分变化率最低(6.5%、5.4%)。变化率越大表示水解产物与表位抗体间的结合能力越弱,表明该成分提取物对TM的免疫活性影响越大,反之亦然。

Ruan Weiwei等研究了美拉德反应对拟穴青蟹中TM以及精氨酸激酶的致敏性影响,发现美拉德反应可以使易消化抗原表位大量消失,且对具有抗消化能力的抗原部分具有一定破坏性,从而降低其致敏性;Fu Linglin等研究发现,美拉德反应可以消除一部分表位的过敏性,进而影响TM蛋白的致敏性。结合二级结构变化结果,认为菌体碎片、氨基甲基化菌体的TM水解产物与3 个表位抗体的结合反应变化率显著低于其他成分提取物,其原因很可能是两者对TM的这3 种致敏表位的破坏程度较小。此外,发现所有成分对Epitope 2抗体的结合反应变化率显著低于Epitope 1和Epitope 3,这可能是因为Epitope 1与Epitope 3氨基酸序列中的赖氨酸及谷氨酸在植物乳杆菌水解TM的过程中会发生交联反应,导致结构发生变化,增加了表位的破坏程度。

2.5 植物乳杆菌对TM的消减作用位点分析

不同处理植物乳杆菌的TM水解产物的免疫学分析以及TM二级结构变化数据显示,菌体对TM蛋白空间结构及致敏表位破坏程度最大,菌体碎片和氨基甲基化菌体破坏程度最小,其他几种处理菌体对TM结构及表位的破坏程度无较大差别。为了解析植物乳杆菌对TM免疫活性的可能消减作用位点,选取菌体、羧基酯化菌体、菌体碎片和氨基甲基化菌体及其TM水解产物的样品进行傅里叶变换红外光谱分析。对比分析各成分提取物及其TM水解产物的二阶导数谱图,发现谱图变化主要集中在1 800~1 500 cm-1范围(图2)。各成分提取物水解TM前后的峰形大致保持不变,但其中一部分峰形变得明显尖锐,峰面积也明显增大。

图 2 植物乳杆菌不同成分提取物及TM消减产物的傅里叶变换红外光谱二阶导数谱图

红外光谱二阶导数谱图|北纳生物

由表1可知,各提取物在水解TM后,红外谱图吸收峰变化集中在C=O引起的伸缩振动吸收峰、N—H键引起的弯曲或变角振动吸收峰。其中菌体的TM水解产物有N—H键引起的5 个变角振动吸收峰((1 648±1)、(1 641±1)、(1 630±1)、(1 624±1)、1 613 cm-1)、3 个弯曲振动吸收峰( 1 659 、 ( 1 540 ± 1 ) 、(1 534±1) c m -1)、2 个面内弯曲振动吸收峰((1 559±1)、1 696 cm-1)和C=O引起的3 个伸缩振动吸收峰((1 773±1)、1 724、(1 711±1)cm-1)的峰形或峰面积发生了变化。与菌体相比,羧基酯化菌体的TM水解产物有N—H键引起的3 个弯曲振动吸收峰(1 659、1 541、1 535 cm-1)、2 个面内弯曲振动吸收峰((1 558±1)、1 695 cm-1)、2 个变角振动吸收峰((1 648±1)、(1 630±1)cm-1)和C=O引起的2 个伸缩振动吸收峰(1 773、(1 723±1)cm-1)的峰形或峰面积发生了变化;菌体碎片水解产物有 N — H 键引起的 3 个弯曲振动吸收峰( 1 658 、(1 540±1)、(1 530±1)cm-1)、3 个变角振动吸收峰((1 648±1)、1 631、(1 618±1)cm-1)和C=O引起的1 个伸缩振动吸收峰((1 773±1)cm-1)的峰形或峰面积发生了变化。

氨基甲基化菌体的水解产物有N—H键引起的2 个变角振动吸收峰(1 668、1 648 cm-1)、1 个面内弯曲振动吸收峰(1 700 cm-1)和C=O引起的1 个伸缩振动吸收峰((1 717±1)cm-1)的峰形或峰面积发生了变化。比较发现,各提取物及其TM水解产物的红外谱图主要是N—H键的振动吸收峰发生了变化,其中菌体的3 个N—H键特征峰变化数量最多(10 个),其次是羧基酯化菌体(7 个)和菌体碎片(6 个);而氨基甲基化菌体的3 个N—H键特征峰的变化数量最少,仅为3 个(1 700、1 668、1 648 cm-1),且菌体碎片和氨基甲基化菌体的变化强度均小于菌体和羧基酯化菌体。结合免疫学分析结果,推测,氨基很可能是植物乳杆菌消减TM免疫活性的一个重要作用位点。

表 1 植物乳杆菌不同成分提取物及TM水解产物的傅里叶变换红外光谱二阶导数谱图分析

植物乳杆菌|北纳生物


3 结 论

本研究通过对比分析植物乳杆菌菌体和各种不同成分提取物对TM免疫活性的影响作用和作用方式,发现植物乳杆菌会较大程度地改变TM的二级结构并破坏其致敏表位,其中氨基甲基化菌体和菌体碎片对TM的α-螺旋结构和致敏表位的破坏最小,且TM的折叠化结构较少,因而对TM的免疫活性消减率最低。此外,研究发现氨基很可能是植物乳杆菌消减TM免疫活性的一个重要作用位点。本研究可为今后食物过敏原的活性控制以及低致敏性水产加工制品的开发提供科学依据。

相关链接:氨基甲基化菌,菌体,硫酸铵蛋白质赖氨酸谷氨酸植物乳杆菌北纳生物

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