北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

奇异变形杆菌检测方法研究进展

发布时间:2021-10-22 16:29 作者:北纳生物编辑-陈丹

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种两端钝圆、兼性厌氧、属于肠杆菌科变形杆菌属的革兰氏阴性菌,以杆状为主,大小为(0.4~0.6)μm×(1.0~3.0)μm,没有芽抱和荚膜,大小形态各异,有鞭毛和菌毛,具有粘附性。该菌主要存在于人与动物的体表黏膜与消化道,生成的相关毒素可导致食物中毒,有些可以和化脓性球菌混合感染,引起继发性感染等。容易引起尿道炎、肾盂肾炎、中耳炎和菌血症等多种疾病。1989年,江益民等首次从病死肉鸡中分离到奇异变形杆菌,染病的肉鸡表现出热应激反应,具有较高的发病率与死亡率。该菌包括内源性与外源性2种传染方式,通常由污染的水与饲料经消化道传染,或吸入污染的空气与尘埃经呼吸道感染。当饲料霉变、卫生状况差、温度急剧变化、转群时容易引起应激反应进而诱发该病。近年多种动物相继都感染该菌,如鹌鹑、鸽子、貂,给畜禽养殖场带来巨大的经济损失。

1 奇异变形杆菌菌落及生化鉴定

1.1 菌落鉴定

奇异变形杆菌营养要求不高,在不同培养基中,PM的颜色形态各不相同,该菌不耐热,通常在55 ℃的条件下持续加热60 min能消除该菌。PM适宜的生长温度为10~43 ℃,在这一温度范围内均能顺利繁殖。若将奇异变形杆菌放在浓度为0.5%~3.0%的琼脂平板上可表现出迁徙生长现象。在SS琼脂平板生长时,呈现圆形、扁薄、半透明的菌落,易与其他肠道致病菌混淆;在血琼脂平板生长时,出现溶血现象,能迅速分解尿素;在麦康凯平板生长时,易于分解单个菌落。在0.1%石碳酸或0.4%硼酸平板生长时,奇异变形杆菌扩散生长受到抑制,形成单个菌落;在固体平板生长时,其形态特征为短杆菌与纤细状长条菌的交替改变,通常将其称为Swimmer细胞与Swarmmer细胞。相关学者围绕其生物学特征将其命名为繁殖体与潜生体,英文名称分别是vegetative cells,VC与Cryptic growth cells,CGC。

1.2 细菌生化鉴定

生化鉴定是细菌鉴定中最重要也是最传统的一种方法,主要是借助细菌对营养物质分解能力的不同及其代谢产物的差异对细菌进行鉴定,包括蛋白质分解产物试验、糖分解产物试验、氧化酶试验、凝固酶试验等。将待检细菌接种至对应的微量生化管内,置于37 ℃条件下培养,24 h后观察并做好记录。根据ATB微生物鉴定系统说明书开展鉴定工作,取接种环轻轻沾取该菌落,将其放入准备好的灭菌生理盐水中,借助API麦克法兰标准比浊管把菌液浓度调为1.5,最后将生化试条加入其中。之后把试条置于温箱内培养24 h,温度设为37 ℃,参照ATB微生物鉴定说明书中试条颜色标准评定结果阴阳性,然后把结果录入生化鉴定软件内作进一步判断。该菌较为明显的生化特点就是尿素酶、硫化氢、苯丙氨酸脱氢酶均呈阳性,此鉴定方法繁琐复杂、耗时耗力。

2 血清学诊断

2.1 平板凝集反应检测法

有学者于2006年为有效方便地对奇异变形杆菌的血清进行流行病学调查,进而建立一种平板凝集反应检测方法。方法如下:取待检血清,用PM平板凝集诊断抗原开展平板凝集反应,同时进行阳性对照,阴性对照以及空白对照。当阴性对照结果为阴性,阳性对照结果为阳性,空白对照未发生自凝现象时对检验结果予以判定。此外,选取分离菌制作染色抗原,并与PM阳性血清进行平板凝集反应,记录好结果。此法能短时间内诊断该菌,进而为奇异变性杆菌的流行病学调查提供了极大便利。

2.2 免疫荧光抗体诊断法

此法是基于免疫反应的特异性与灵敏性特点,并与显微镜技术相结合的一种免疫标记检测技术,已在现代免疫学研究中广泛应用。通常选用的标记物包括四甲基异硫氰酸罗达明、异硫氰酸荧光素(FITC)等荧光素。标记物与已知抗体结合作为检测试剂,共同检测未知抗原。然后借助荧光显微镜可发现有荧光特异性的相关抗原抗体结婚晚,进而清楚抗原所在具体部位。朱明华[6]等研究了一种直接荧光抗体检测方法,利用了该菌的外膜蛋白(OMP)、用FITC标记的相关纯化IgG以及兔抗鸡奇异变形杆菌外膜蛋白高免血清。据相关研究显示,此法不仅操作简便,而且特异性高、敏感性好,为PM的临床检测提供了技术保障。

2.3 酶联免疫吸附测定方法

外国学者于1971年通过碱性磷酸酶对相关抗原与抗体进行标记,进而研发出酶联免疫吸附检测法,即ELISA法。该检测技术已广泛应用于病毒的血清学检测领域,目前也已广泛应用于细菌学检验。2001年,裴标等建立了一种对嗜碱耐盐奇异变形杆菌病原学鉴定的ELISA法。此法的操作流程如下:把相关抗原或抗体吸附在固载体上面,然后对其进行免疫酶染色处理,底物经显色后可直接通过肉眼观察结果或则利用分光光度计判断结果。

3 细菌鉴定分子生物学方法

3.1 PCR检测法

该技术具有良好的敏感性与特异性,属于临床微生物检验的最佳方法。目前,此法已用于很多细菌与病毒感染疾病的早期诊断、相关遗传病的诊断、基因分析等领域,现已衍生出多种PCR技术,如多重PCR、原位PCR、巢式PCR等。在奇异变形杆菌检测中PCR技术受到日益重视,外国学者将16SrRNA、ureC等基因作为靶基因,研究出了专门检测奇异变形杆菌属的PCR检测法,为后来该菌的PCR检测工作打下基础。围绕编码奇异变形杆菌的脲酶调节子(ureR)的基因序列设计2条引物建立PCR方法,该方法有效区别了奇异变形杆菌和普通变形杆菌;毕水莲[9]等发现了atPD基因、tuf基因,将其作为靶基因,研发出新的PCR法,用于检测奇异变形杆菌。以上PCR方法均具有快速、准确、灵敏、特异的优点。

3.2 实时荧光定量PCR法

此法英文简称为real-time PCR,将荧光基团添加到PCR反应体系内,借助荧光信号积累进而对PCR的整个过程加以实时监控,最后利用标准曲线定量分析研究未知模板。此法不仅灵敏度好、特异性好、可重复,而且定量精准、快速,属于全封闭反应。目前应用较多的real-time PCR检测方法包括TaqMan探针与SYBR Green标记。毕水莲[9]等人于2008年就新发现的PM菌属的atpD基因序列设计了相关引物,构建出SYBR Green荧光定量PCR法。ZHANG[10]等于2013年找到了SYBR Green荧光定量PCR法,能快速鉴别PM,并能对该菌的DNA以及细菌数量进行定量。2017年,史瑞雅等针对鸡奇异变形杆菌全基因序列设计了1对特异性引物,建立检测鸡奇异变形杆菌的SYBR GreenⅠLC-PCR检测方法,该方法可用于鸡奇异变形杆菌的监测和早期临床诊断。

3.3 环介导等温扩增技术(LAMP)

日本学者在2000年研发出一种新的核酸扩增技术,即环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)。该技术通过在恒温条件下使用一种能链置换的DNA聚合酶以及可以识别靶序列上面6个位点的4个特殊设计的引物,实现对核酸的高效、迅速、特异扩增。由于该技术不佳操作简便、耗时短、而且灵敏性与特异性好,产物易检查,已大量应用在食品安全检测行业中。苏良[12]等在2010年研究了一种检测奇异变形杆菌的LAMP检测法,它是根据奇异变形杆菌脲酶调节子编码基因(ureR)特异序列的6个位点设计出对应的4个LAMP引物。王鹏等在2011年围绕变形杆菌属atpD基因序列,设计出对应的6个引物,包括内引物、外引物、环引物各2个,构建出检测PM菌属的LAMP法。此法能检测普通变形杆菌以及奇异变形杆菌,可直接检测食品样品。

4 结束语

奇异变形杆菌造成的畜禽感染事件在近年经常发生,它属于仅次于沙门氏菌的一种强致病菌。现在很多学者通过采用新型技术去检测奇异变形杆菌,如高兴等在2013年将UreR基因作为靶基因,利用多重PCR制作出检测细菌基因芯片的检测方法,可以检测11种食源性细菌基因芯片。此法还能对多种病原体与多种基因进行同时检测与分析。MEZGER[15]等在2015年建立了检测致病菌的可伸缩的基于DNA的磁性纳米颗粒凝集方法,该方法不需要改变温度就能制备大量的DNA,可用于平行检测多种病源菌。

变形杆菌技术的不断发展和创新,为后续该菌属的耐药特征和防控机制研究奠定了基础,可用于兽医临床分离鉴定以及临床合理用药指导,进而减少耐药菌株产生。

相关链接:奇异变形杆菌普通变形杆菌石炭酸苯丙氨酸脱氢尿素酶北纳生物

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