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松油烯-4-醇对荧光假单胞菌抑菌能力(二)

发布时间:2022-07-01 15:28 作者:北纳生物编辑-陈丹

2 结果与分析

2.1 松油烯-4-醇的MIC及其对荧光假单胞菌时间抑菌曲线

如图1所知,不同终剂量的松油烯-4-醇对荧光假单胞菌均有抑制作用,终剂量为0.25、0.5、1 μL/mL的松油烯-4-醇对荧光假单胞菌具有轻微的抑制生长作用。在培养至对数生长期(107 CFU/mL)的荧光假单胞菌中加入终剂量为2 μL/mL的松油烯-4-醇培养12 h后,其菌液密度低于等体积终质量浓度为50 μg/mL卡那霉素的阳性对照,表明松油烯-4-醇对荧光假单胞菌的MIC为2 μL/mL。与Kang Shimo等研究的抑菌剂乳糖醛酸相比,松油烯-4-醇对荧光假单胞菌具有较好的抑菌效果。


图1 不同剂量的松油烯-4-醇对荧光假单胞菌抑菌效果

由图2可知,加入1、2、4 MIC的松油烯-4-醇在培养2 h后对荧光假单胞菌的生长产生了明显的抑制作用,与空白对照相比差异较大。随着培养时间的延长,松油烯-4-醇对荧光假单胞菌的抑菌能力没有变化,表明松油烯-4-醇有较强的抑菌能力,并具有良好的抑菌稳定性。


图2 不同剂量的松油烯-4-醇对荧光假单胞菌的时间抑菌曲线

2.2 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌细胞壁的影响

AKP是一种大量存在于微生物中的磷酸水解酶,其在磷酸盐的代谢中起着无可替代的作用。AKP存在于细胞壁与细胞膜之间,当细胞壁或细胞膜的完整性遭到损伤,AKP便会泄露到菌液中,使菌体内AKP活力降低。本实验通过测定松油烯-4-醇对AKP活力的影响,以反映其对荧光假单胞菌细胞壁的损伤情况。如图3所示,经4 h松油烯-4-醇培养后,空白对照组AKP活力明显增加;1、2、4 MIC处理组AKP活力下降明显。结果表明,0~4 h培养后的空白对照组菌体生长,使其胞内AKP活力增加;处理组AKP活力随松油烯-4-醇剂量的增加及培养时间的延长而降低,表明松油烯-4-醇能有效地破坏荧光假单胞菌的细胞壁并且可能改变细胞膜的通透性,使胞内AKP活性降低。这与柏梅研究发现山苍子精油能够破坏金黄色葡萄球菌菌体的细胞壁及细胞膜,使胞内AKP活力被抑制的实验结果相同。


图3 松油烯-4-醇对AKP活力的影响

2.3 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌内电导率的影响

当抑菌剂作用于菌体后,会使菌体细胞膜的通透性增加,导致胞内的钾离子、钙离子、氢离子等小离子从膜内外泄,这些离子会平衡细胞的能量状态,使菌体进行正常运动,还具有代谢控制、溶质转运等作用;因此,测定电导率以表征松油烯-4-醇对荧光假单胞菌细胞膜的渗透性变化。如图4所示,在加入松油烯-4-醇后0~6 h,1 MIC与2 MIC处理的荧光假单胞菌电导率迅速增加,明显高于空白对照组,且2 MIC样品的电导率大于1 MIC。表明随着松油烯-4-醇的剂量增加,其电导率增大,松油烯-4-醇破坏了荧光假单胞菌的细胞通透性,进而导致细胞内离子外渗;6~12 h,两种剂量的松油烯-4-醇处理组增长都趋于平缓,表明松油烯-4-醇能有效改变荧光假单胞菌细胞膜的通透性,使膜内外电导率增加。此结果与测定AKP活力得到的结果都表明松油烯-4-醇能破坏荧光假单胞菌的细胞壁且改变细胞膜的通透性。Zhang Yunbin等研究了肉桂精油对大肠杆菌的抗菌机制,也发现加入肉桂精油会使菌液电导率升高,对细胞膜通透性造成影响,与本实验结果相同。


图4 不同剂量的松油烯-4-醇对荧光假单胞菌电导率的影响

2.4 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌细胞膜通透性的影响

FDA是一种本身不发荧光且不带电荷的物质,因其是脂质性小分子,更易透过细胞膜进入细胞,在胞内被非特异性脂酶催化,FDA会产生黄绿色的荧光素。当细胞膜完整,FDA会在激发和发射波长分别为488 nm和530 nm处被检测出;当细胞膜遭到破坏,FDA很快流出细胞,不能被检测到。通过测定FDA荧光强度的大小,可反映出细胞膜的通透性与完整性。经松油烯-4-醇对荧光假单胞菌处理2 h后,1、2、4 MIC处理组与空白对照组测定的荧光强度差异不大,表明经松油烯-4-醇处理的荧光假单胞菌的细胞膜完整性较好,仅细胞膜通透性有所降低;经松油烯-4-醇处理5 h和8 h,1、2、4 MIC处理组荧光强度随剂量增加及时间的延长而降低,表明从培养5 h起,松油烯-4-醇能大幅增强荧光假单胞菌细胞膜的通透性,并可能对细胞膜产生破坏作用,导致FDA外渗,荧光强度降低。随着松油烯-4-醇剂量的增加及培养时间的延长,对荧光假单胞菌的损伤程度也越大。

2.5 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌超微结构的影响

SEM可以更直观、更清晰地观察到松油烯-4-醇对荧光假单胞菌菌体损伤情况。正常的荧光假单胞菌(为空白对照组),其菌体饱满、完整、且表面光滑的短杆状形态;经1 MIC与2 MIC的松油烯-4-醇处理后,菌体表面变得粗糙,细胞膜均有破裂,2 MIC处理组菌体皱缩塌陷,与1 MIC处理组相比,其细胞膜破坏程度更为严重;4 MIC松油烯-4-醇处理组,其菌体破碎、部分菌体被溶解、细胞膜几乎完全破裂。上述结果表明1、2、4 MIC的松油烯-4-醇处理组能对荧光假单胞菌细胞壁和细胞膜产生不可逆的损坏,且破坏程度随着松油烯-4-醇剂量增大而增强,细胞壁及细胞膜的破坏导致细胞内容物外泄,菌体干瘪并产生皱缩,从而抑制荧光假单胞菌的生长。植物精油类抗菌物质,因其疏水性更易作用于细胞膜,使细胞膜破损,并增强了细胞膜的通透性。此结果与抑菌曲线结论一致,松油烯-4-醇能够抑制荧光假单胞菌的生长。Zhao Yi等用SEM观察发现没食子酸能改变金黄色葡萄球菌的疏水性,对细胞膜造成破坏,导致细胞内成分泄露,与本研究结果相同。

2.6 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌DNA含量的影响

DNA中含有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息,是生物发育和正常运转所不可或缺的大分子物质。DNA含量的减少和损伤导致基因无法正常表达,使胞内的酶与受体合成受阻,最终导致其衰亡。琼脂糖凝胶阻滞电泳中的DNA条带亮度与DNA分子大小成正比,条带亮度能够反映DNA含量。经3 h的松油烯-4-醇培养后,空白对照组的DNA条带明亮清晰,0.5、1、2、3 MIC处理组的DNA条带亮度依次随着松油烯-4-醇的剂量增大而降低,4 MIC处理组检测不出荧光假单胞菌的DNA。以上结果表明松油烯-4-醇能破坏荧光假单胞菌的细胞膜,使胞内DNA泄露,且随着松油烯-4-醇的剂量增大,对荧光假单胞菌细胞膜的破坏也越强,胞内剩余的DNA含量越少。此结果与上文中SEM、电导率、FDA实验结果相印证,松油烯-4-醇能够有效破坏荧光假单胞菌细胞膜,不仅导致小分子外泄,大分子的DNA也会随之泄露出来。Shen Suxia等研究发现肉桂醛对金黄色葡萄球菌产生抑菌作用时菌体细胞壁和细胞膜破裂,内部空化,核酸大分子物质外渗。

2.7 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌总蛋白质量浓度的影响

蛋白质是生命物质的基础,是构成细胞最重要的成分,具有维持细胞内渗透压、酸碱度、运输代谢物等重要作用,蛋白质的降低会直接影响细胞的活力。空白对照组中随着培养时间的延长,荧光假单胞菌代谢繁殖,其胞内蛋白质量呈现上升趋势;经1 MIC和2 MIC松油烯-4-醇处理0~3 h的菌体,胞内蛋白质量浓度迅速降低,此时松油烯-4-醇对菌体细胞膜破坏严重,蛋白质大量外渗;3~12 h两处理组的蛋白质量浓度均缓慢下降,可能是0~3 h松油烯-4-醇对细胞膜破坏较严重,蛋白质已较多泄露所致。测定结果表明松油烯-4-醇能大幅度且迅速破坏荧光假单胞菌的细胞膜,使其通透性增强,导致大分子蛋白质泄露,并且随着松油烯-4-醇的剂量增加,对细胞内蛋白的含量影响越大,此结果与SEM、核酸电泳结果相印证。松油烯-4-醇也可能会破坏细胞内蛋白质的合成,从而影响细胞的生长与代谢。Yin Lizi等研究了肉桂醛对嗜水气单胞菌的抑菌机制,表明肉桂醛可以降低细胞中的蛋白含量,干扰细胞代谢,影响了细胞膜的通透性。

2.8 松油烯-4-醇对荧光假单胞菌细胞内Na+、K+-ATP酶活力的影响

Na+、K+-ATP酶是一种处于细胞质膜磷脂双分子层中的蛋白酶,能催化ATP水解为细胞直接提供能量,在物质运输、能量转化、调节膜电位及传递信息方面具有重要作用,细胞膜的损伤和重要离子的泄露会对细胞膜相关的能量转导系统产生影响。空白对照组0~6 h因荧光假单胞菌的增殖,胞内Na+、K+-ATP酶活力增强;1、2 MIC处理组在0~6 h培养后,Na+、K+-ATP酶活力与空白对照组相比明显降低,且2 MIC松油烯-4-醇对荧光假单胞菌Na+、K+-ATP酶抑制能力更为出色。对测定结果分析可知,松油烯-4-醇可能对荧光假单胞菌细胞内的蛋白质有明显抑制作用,从而阻碍了胞内酶的合成,Na+、K+-ATP酶也遭到破坏导致胞内ATP不能正常供给能量,最终细胞凋亡。此结果与松油烯-4-醇对胞内总蛋白、电导率、核酸电泳的影响结果相印证,表明松油烯-4-醇能有效破坏荧光假单胞菌细胞膜的完整性,增加离子的通透性及细胞内Na+、K+-ATP酶的外渗。Sharma等研究表明大蒜精油会显著降低蜡状芽孢杆菌胞内ATP的释放。

3 结 论

天然植物精油类物质具有安全无毒、抗菌光谱性强、原料来源广泛等特点,作为食品防腐剂日益受到众多学者们的关注。松油烯-4-醇是茶树精油的主要有效成分之一,也是多种天然植物精油所含的单萜类成分,具有抗肿瘤、抗炎等作用,但对其抑菌能力报道尚少。

本研究从细胞机制方面探讨了松油烯-4-醇对荧光假单胞菌的抑制作用。本实验首先确定了松油烯-4-醇对荧光假单胞菌具有良好的抑菌效果,且明确其MIC为2 μL/mL;由时间抑菌曲线进一步看出松油烯-4-醇可较为迅速地抑制荧光假单胞菌的生长;AKP活性实验表明加入松油烯-4-醇能有效破坏菌体细胞壁,使细胞膜暴露出来;电导率测定结果证明松油烯-4-醇可以改变细胞膜的通透性,使胞内离子外泄;胞内荧光强度测定结果证实松油烯-4-醇能大幅增强细胞膜的通透性,并可能对细胞膜产生破坏作用;SEM观察到松油烯-4-醇对细胞膜造成了不可逆的损伤,大分子的DNA与蛋白质会从细胞内泄露,胞内的Na+、K+-ATP酶含量也会降低,导致ATP无法正常提供细胞能量,直接造成细胞凋亡。

相关链接:荧光假单胞菌松油烯-4-醇乳糖醛酸,抗菌剂,金黄色葡萄球菌北纳生物

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