北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心

  • 质量管理体系认证证书 质量管理体系认证证书
  • 工程技术研究中心 工程技术研究中心
  • 高新技术企业证书 高新技术企业证书

植物乳杆菌对溶藻弧菌的抑菌活性(一)

发布时间:2022-07-05 15:30 作者:北纳生物编辑-陈丹

(Selenium)是一种非金属元素,化学符号是Se,在化学元素周期表中位于第四周期VI A族(第34号元素)。可以用作光敏材料、电解锰行业催化剂、动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素等。研究发现纳米硒具有低毒、高活性、易吸收等优势,因而在抗氧化、抗癌、抗菌、促进生长等方面展现出良好的应用前景。微生物可通过同化还原、异化还原和生物群落甲基化等作用,将环境中有毒的亚硒酸阴离子还原为毒性较低的单质硒,积累在细胞内或分泌在胞外,合成的纳米硒具有典型的红色球形,稳定性好、生物相容性高。乳酸菌是一类具有促进生物体肠道内菌群生态平衡,对宿主起有益调节作用的微生物菌群,具有公认的安全性。课题组前期研究筛选到1 株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP21,具有对亚硒酸钠耐受能力强、纳米硒转化率高的优势。

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)为河口和海洋的正常环境菌,是各种水产养殖中的一种主要的条件致病菌,容易导致鱼虾等患疾病甚至死亡,是引起海洋动物和水产养殖大流行性疾病的重要致病菌。为了减轻染病造成的致命后果,目前过度使用抗生素或化学杀菌剂在水产养殖中很常见,引起超级细菌和耐药性基因的产生、传播,已成为危害公共安全问题之一。预防和控制水产养殖设施中的致病性感染是目前亟需解决的问题。

纳米硒颗粒具有抗菌的特性,而且对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和念珠菌(Candida spp.)具有抗生物膜活性,但是应用于溶藻弧菌的抑菌活性还鲜见报道。本研究拟采用植物乳杆菌LP21在生长繁殖中转化合成纳米硒,利用透射电镜、粒径仪、X射线衍射、红外光谱对制备的纳米硒进行结构和性能表征,并对其抑制溶藻弧菌的生长繁殖、运动性、生物膜形成、细胞形态等进行研究,旨在为渔业养殖提供一种无毒和有益环境奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

植物乳杆菌LP21、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

1.1.2 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基:胰蛋白胨10.0 g、酵母菌粉5.0 g、氯化钠30.0 g、蒸馏水1 000 mL、琼脂粉(固体培养)15.0~20.0 g。

改良MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基:蔗糖20.0 g、牛肉膏5.0 g、硫酸锰0.05 g、蛋白胨10.0 g、乙酸钠5.0 g、硫酸镁0.2 g、磷酸氢二钾2.0 g、吐温80 1 mL、柠檬酸三铵2.0 g、酵母菌粉4.0 g、蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 试剂

亚硒酸钠 山东西亚试剂有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS) 西陇科学股份有限公司;过氧化氢、无水乙醇 天津市天力化学试剂有限公司;NaOH、硝酸、高氯酸 天津科密欧化学试剂有限公司;乙酸 天津市北辰方正试剂厂;结晶紫常德比克曼生物科技有限公司;溴化钾(光谱纯)天津恒创立达科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱 重庆试验仪器设备厂;压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械有限公司;紫外-分光光度计 上海光谱仪器有限公司;LGJ-15D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂;Phenom Pro X飞纳扫描电镜 复纳科学仪器(上海)有限公司;H-7650透射电子显微镜 日本日立公司;D/max2200PCX光衍射仪、Vertex70红外光谱仪德国布鲁克公司;Litesizer™ 500纳米粒度仪 奥地利安东帕有限公司;Scientz-1500F超声波分散仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;IRIS Intreid II电感耦合等离子发射光谱仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌LP21合成纳米硒

将活化3 次的植物乳杆菌LP21以2%接种量,接种于含亚硒酸钠质量浓度1 g/L的改良MRS液体培养基中,其中亚硒酸钠需单独灭菌后加入,35 ℃厌氧瓶培养72 h后,10 000 r/min离心10 min,沉淀经蒸馏水洗3 次得到纳米硒-植物乳杆菌,4 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 透射电镜观察纳米硒-植物乳杆菌

吸取纳米硒-植物乳杆菌滴加于铜网上,滤纸吸去多余水分,红外线灯照射干燥后,透射电镜观察,能谱仪分析。

1.3.3 纳米硒的分离

将纳米硒-植物乳杆菌用0.1 g/100 mL SDS(1 mol/L NaOH溶液配制)悬浮,超声波分散仪300 W,3 s/停3 s,处理15 min,3 000 r/min离心10 min,收集上清液12 000 r/min离心10 min,蒸馏水洗涤3 次重悬,然后通过0.45 μm微孔滤膜过滤,冷冻干燥制备得到纳米硒颗粒,进行结构表征及抑菌活性研究。

1.3.4 纳米硒粒径分析

取纳米硒重悬,分别滴加于一次性比色皿中,置于纳米粒度仪卡槽中,测定粒径。设定预热时间120 s,测量温度25 ℃,测量次数3 次。

1.3.5 纳米硒红外光谱分析

采用溴化钾压片法,傅里叶红外光谱仪对纳米硒进行检测,光谱测定范围400~4 000 cm-1。

1.3.6 纳米硒X射线衍射分析

采用X射线衍射对纳米硒结构进行分析,以CuKα射线为辐射源(λ=0.154 nm),电流50 mA,电压40 kV。

1.3.7 平板抑菌活性测定

将纳米硒-植物乳杆菌、纳米硒用硝酸-高氯酸混酸消化,方法详见文献,电感耦合等离子发射光谱仪测定硒含量,并稀释到250 μg/mL与相同质量浓度亚硒酸钠分别制备成样品1、2、3。对照为植物乳杆菌及0.22 μm滤膜过滤后的发酵液,分别为样品4和5。

将指示菌溶藻弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌按1%的接种量分别接入LB液体培养液中,37 ℃恒温培养24 h,测定菌液OD600 nm值并稀释至1.0。培养皿注入20 mL LB固体培养基,水平放置使之凝固,将1 mL指示菌均匀涂布培养基上,放入浸泡有样品的滤纸片,37 ℃培养24 h,测量抑菌圈直径,每个处理3个平行。

1.3.8 纳米硒对溶藻弧菌生长的影响

采用二倍稀释法,确定纳米硒的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

将指示菌溶藻弧菌按1%的接种量,分别接入添加纳米硒亚抑制剂量143 μg/mL的LB培养液中,37 ℃、150 r/min振荡培养,以未添加纳米硒的无菌培养基为对照,采用比浊法,每隔2 h取出1 mL菌液,3 倍稀释后600 nm波长处测定OD值,观察菌体生长情况,绘制生长曲线。

1.3.9 纳米硒对溶藻弧菌生物膜形成的抑制

采用结晶紫染色法测定纳米硒对溶藻弧菌生物膜的抑制作用。将含亚抑制剂量143 μg/mL纳米硒的5 mL LB装在干净的无菌玻璃管中,接种0.05 mL溶藻弧菌,以不含纳米硒的培养为对照,37 ℃培养48 h后,弃去培养基,附着的细胞用磷酸盐缓冲液(phosphate buffersaline,PBS)洗涤,1 g/100 mL结晶紫染色,水冲洗,33%(V/V)乙酸溶液脱色,在570 nm波长处测定洗脱染料OD值。

1.3.10 纳米硒对溶藻弧菌运动性的影响

在含琼脂0.5 g/100 mL(软板)和1.5 g/100 mL(硬板)固体LB平板上测定纳米硒对溶藻弧菌的游动和群集能力的影响。溶藻弧菌分别点样在含亚抑制剂量纳米硒的软板和硬板上,并用不含纳米硒的培养作对照,24 h后拍照记录。

1.3.11 扫描电镜观察纳米硒对溶藻弧菌形态的影响

将指示菌溶藻弧菌按1%的接种量分别接入LB培养液中,37 ℃恒温培养8 h后,添加纳米硒质量浓度为143 μg/mL,继续培养24 h后,5 000 r/min离心10 min,PBS洗涤3 次,收集沉淀,乙醇梯度洗脱,样品处理详见文献。扫描电镜观察菌体形态。

1.4 数据统计及图表绘制

所有实验均重复3 次,结果以表示,采用SPSS Statistics 19.0进行数据统计分析,OriginPro 8.5软件作图。

相关链接:植物乳杆菌溶藻弧菌铜绿假单胞菌氯化钠十二烷基硫酸钠大肠杆菌北纳生物

本文章来源于——《食品科学网》,如有版权问题,请与本网联系

点赞图片

登录后才可以评论

立即登录
推荐阅读
请告知您的电话号码,我们将立即回电

通话对您免费,请放心接听

温馨提示:

1.手机直接输入,座机前请加区号 如13164239859,010-58103778

2.我们将根据您提供的电话号码,立即回电,请注意接听

3.因为您是被叫方,通话对您免费,请放心接听

关闭
大抽奖
请设置您的密码:
分享到微信