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探讨盐酸小檗碱抑制指状青霉的作用机制(一)

发布时间:2022-08-09 15:22 作者:北纳生物编辑-陈丹

近年来,植物次生代谢产物生物碱对植物病原真菌的抑制作用引起了广泛关注。潘佳亮发现苦参碱能有效抑制山核桃干腐病菌的孢子萌发,且抑制菌丝体生长的半抑制浓度为1.512 mg/mL。Zhao Zhongmin等研究表明异喹啉类生物碱对植物病原真菌具有广谱抑菌性,其中血根碱抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)等8 种植物病原菌生长的抑制中浓度在6.96~59.36 μg/mL之间。Oliva等从芸香叶(Ruta graveolens)提取的喹诺酮生物碱对灰葡萄孢(B.cinerea)也具有高度抑菌活性。

小檗碱(berberine)又名黄连素,属于异喹啉类生物碱,主要以盐酸盐形式广泛存在于小檗科、毛莨科、芸香科植物中。盐酸小檗碱具有广谱抑菌性,因其多靶位抑菌机制,使致病菌不易产生耐药性,常作为抗肿瘤、抗炎、抗菌成分应用于临床制剂中。据报道,从黄连根中提取的小檗碱氯化物可有效抑制小麦白粉病菌、灰葡萄孢菌(B.cinerea)、叶锈病菌的生长,其半数致死浓度分别为190、80、50 μg/mL。谭婷等从紫叶小檗果中提取的小檗碱在质量浓度为4 mg/mL时对尖孢镰刀菌的抑菌率为89.23%。阮元等在离体条件下测定BH对19 种植物病原菌的抑制作用,结果显示100 μg/mL BH对尖孢镰刀菌、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、苹果斑点落叶病菌(A.alternata)的生长抑制率均高于75%。Hou Dongyao等发现BH抑制桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)生长的最低抑菌质量浓度为46.9 μg/mL。

本研究拟通过离体实验探究BH对指状青霉的抑菌活性,利用活体实验研究BH对柑橘果实绿霉病的防控作用;进一步从病原菌菌丝体表面形态、细胞壁完整性、细胞膜通透性、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及能量代谢方面对BH抑制指状青霉的作用机制进行初步探讨,为柑橘采后绿霉病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

指状青霉(Penicillium digitatum)菌株。柑橘果实品种为‘宫川’(Citrus unshiu Marc.cv.Miyagawa Wase)。

盐酸小檗碱水合物(纯度98%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;钙荧光白试剂(calcofluor white,CFW)、碘化吡啶(pyridine iodide,PI)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)检测试剂盒 北京索莱宝科技有限公司;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)试剂盒 南京建成生物工程研究所;2’,7’-二氯二氢荧光素-双乙酸酯(2’,7’-dichlorodihyd rofluorescein diacetate,DCFH-DA)试剂盒 上海索莱宝生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SPX-250B型生化培养箱 上海博迅实业有限公司;SCW-CJ-1F型垂直流洁净工作台 苏州安瑞净化科技有限公司;DDSJ-308A电导仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;RE-2000A型旋转蒸发仪 上海雅荣生化设备仪器有限公司;UV-2450型紫外分光光度计、LC-20AT型高效液相色谱仪 日本SHIMADZU公司;ECLIPSE TS100型荧光显微镜 日本NIKON公司;JSM-6610LV型扫描电子显微镜 日本SANYO电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

将指状青霉接种于PDA平板上活化,(25±2)℃恒温培养5~6 d,用接种环刮取PDA平板上的孢子于无菌水中,纱布过滤掉菌丝,用血球计数板计数,用无菌水配制成1×107、1×105 个/mL的孢子悬浮液备用。

1.3.2 BH抑制指状青霉生长情况的分析

采用液体倍半稀释法测定BH对指状青霉菌丝生长的抑制作用。配制BH终质量浓度分别为0、0.02、0.04、00.8、0.16、0.32、0.64 g/L的PDB,加入孢子悬浮液后,置于恒温振荡培养箱(25±2)℃,160 r/min培养48 h。MIC定义为培养2 d能完全抑制病原菌生长的最低BH质量浓度,将BH质量浓度≥MIC的培养液涂布在PDA平板后继续培养2 d,能完全抑制病原菌生长的最低BH质量浓度即最低杀菌质量浓度(minimum fungicidal concentration,MFC)。将浓度为1×107 个/mL的孢子悬浮液加入BH质量浓度为0.5 MIC和MIC的PDB中,对照为孢子悬浮液加入不含BH的PDB中(25±2)℃、160 r/min分别培养6、9、12、15 h,统计孢子萌发率。

1.3.3 BH处理及柑橘果实绿霉病病斑平均直径的测定

将采摘的柑橘果实于室内放置1 d,自来水清洗,用2%(体积分数)NaClO浸泡2 min,蒸馏水漂洗3 次,自然风干。用小刀在柑橘果实赤道附近划大小为3 mm×3 mm的伤口,接种10 μL浓度为1×105 个/mL的孢子悬浮液。静置4 h后将果实分别浸泡在1 MFC、5 MFC、10 MFC的BH溶液中1 min,对照组为无菌水处理的果实。随后,将柑橘果实置于温度为(23±2)℃、相对湿度为80%~90%的条件下贮藏,用十字测量法每天测量果实的病斑直径,实验重复3 次。采用下列公式计算病斑平均直径,以平均直径表征病斑直径。

1.3.4 菌丝体表面形态观察

取0.5 mL浓度为1×105 个/mL的孢子悬浮液加入50 mL PDB中,(25±2)℃振荡培养2 d。用4 层纱布过滤得菌丝体,加入含不同质量浓度BH(0 MIC(对照组,下同)、0.5 MIC、MIC)的PDB中振荡培养120 min,过滤后用蒸馏水清洗3 次。将收集的菌丝体用3%戊二醛溶液4 ℃固定24 h,用无菌水漂洗20 min,依次用30%、50%、70%、95%乙醇溶液分别处理20 min,最后用无水乙醇脱水45 min。将处理后的菌丝体冷冻干燥,喷金后用扫描电子显微镜观察其表面形态。

1.3.5 菌丝体细胞壁完整性分析

收集培养2 d的指状青霉菌丝体,分别加入含不同质量浓度BH(0 MIC、0.5 MIC、MIC)的PDB中,于160 r/min、(25±2)℃分别振荡培养0、30、60、120 min后过滤。分别收集上清液和菌丝体用于胞外AKP活力的测定及细胞壁完整性测定。取300 μL上清液,参考AKP试剂盒的方法测胞外AKP活力。取少量菌丝体加入10 μL CFW荧光染料处理10 s后加入等体积的10% NaOH溶液,在荧光显微镜下进行观察。

1.3.6 菌丝体细胞膜通透性分析

参照Tang Xu等的方法观察BH对细胞膜通透性的影响。称取0.10 g上述菌丝体,加入1 mL PBS和10 μL 1 g/L PI染液,37 ℃水浴5 min后用PBS清洗3 次,用荧光显微镜进行观察。将上述收集的上清液用电导仪测定电导率。将上述上清液4 000 r/min离心10 min后,取0.5 mL上清加入0.5 mL蒸馏水,与5 mL考马斯亮蓝G-250染剂混匀,595 nm处测吸光度,根据蛋白质标准曲线方程计算可溶性蛋白的质量浓度。

1.3.7 菌丝体活性氧水平及丙二醛浓度分析

用DCFH-DA试剂盒检测菌丝体胞内ROS水平,按照说明书处理待测菌丝体,在荧光显微镜下观察并拍照,用Image-J软件分析荧光强度,以相对荧光值(与初始荧光强度的比值)表征ROS水平。根据丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒提供的方法测定菌丝体胞内MDA的浓度。

1.3.8 线粒体膜电位及能量代谢水平的测定

参考MMP检测试剂盒(JC-10染色法)说明书测定MMP的变化情况,在荧光显微镜下进行观察,并用Image-J软件分析荧光强度,以红/绿荧光强度比值表征MMP。

参照Tang Xu等的方法测定BH对指状青霉ATP含量及胞内能荷水平的影响。称取0.50 g上述菌丝体,加入5 mL沸腾的2 mol/L MgSO4溶液混匀后于100 ℃水浴10 min,冰浴冷却并研磨至匀浆状。4 000 r/min离心10 min,取上清液于高效液相色谱测定胞内ATP含量及能荷水平。实验重复3 次,结果取平均值。

液相色谱条件:C18柱(5 μm×250 mm×4.60 mm);柱温:25℃;流动相为缓冲液:甲醇-缓冲液(含1 mmol/L乙二胺四乙酸-KH2PO4-K2HPO4缓冲液(50 mmol/L、pH 6))体积比为97.5∶2.5;流速:0.80 mL/min;进样体积:20 μL;检测波长:259 nm。

1.4 数据处理与分析

通过Excel软件进行数据处理,结果用平均值±标准差表示,采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析,采用Ducan多重比较进行组间差异性分析,P<0.05表示差异显著,用Origin 8.0软件作图。

相关链接:灰葡萄孢尖孢镰刀菌指状青霉,碘化吡啶,菌株叶锈病菌小檗碱北纳生物

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