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大肠杆菌在枸杞子污染检测中的应用(二)

发布时间:2021-04-02 10:45 作者:陈丹
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2.2 重组质粒构建结果

重组质粒PCR结果显示各个毒力基因的片段大小相一致,表明转入的重组质粒中含有目的基因。将escV、stx2、hlyA重组质粒测序结果与GeneBank上已经公布的序列进行比对,用DNAMAN软件进行序列比对,比对率都为100%、100%、100%,检测结果如图4所示。将经筛选连接转化成功后的重组子继续进行传代培养15 代,并进行质粒提取,每隔代送检测序,测序结果与上述测序结果相同,说明在传代过程中没有发生碱基丢失、错配、突变的现象。

2.3 质粒标准品制备及分析结果

用碱裂解法进行质粒提取,所提质粒用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定质量浓度和纯度如表3所示,A260 nm/A280 nm均在1.8~2.0之间,纯度良好,满足实验要求。将提取的质粒进行测序,GeneBank上已经公布的序列进行比对,比对率均为100%。

表3 重组质粒质量浓度和纯度

2.3.1 均匀性结果

随机挑选escV、stx2和hlyA质粒标准品15 管进行质量浓度测定结果如表4所示,并对测定结果进行方差分析,结果escV、stx2和hlyA质粒标准品质量浓度F值均小于F0.05(14,30)=2.04,15 管之间不存在显著性差异,样品均匀性较好。

表4 escV、stx2和hlyA质粒标准品质量浓度

2.3.2 短期稳定性结果

在25、4、-20 ℃ 3 个温度下贮存14 d,各个质粒标准品质量浓度相近,没有显著性变化(表5),数据之间离散程度较小,PCR扩增均可扩增出单一明亮的特异性条带(图5),说明质粒标准品短期稳定性好。

表5 escV、stx2和hlyA质粒标准品短期质量浓度

图5 escV(A)、stx2(B)和hlyA(C)质粒标准品定性检测结果

2.3.3 长期稳定性结果

在25、4、-20 ℃ 3 个温度下贮存5 个月,各个质粒标准品质量浓度没有显著性变化(表6),数据之间离散程度较小,PCR扩增均可扩增出单一明亮的特异性条带,说明质粒标准品长期稳定性好。

表6 escV、stx2和hlyA质粒标准品长期质量浓度测定

2.3.4 检测限实验结果

如图6所示,通过计算得到escV、stx2和hlyA质粒标准品的检测限分别为3.93×106、2.41×105 拷贝/μL和2.14×105 拷贝/μL。


图6 梯度稀释质粒标准品escV(A)、stx2(B)、hlyA(C)的1.5%电泳结果

2.3.5 质粒标准品在枸杞子中的应用

将34 批枸杞子样品进行escV、stx2、hlyA检测,在34 批枸杞子样品中,没有检测出escV、stx2,16号、33号和34号枸杞子样品中检测出hlyA(图7)。


图7 枸杞子样品中hlyA的PCR检测结果

选择PCR检测结果为阳性的3 批枸杞样品按照GB 4789.6—2016《食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》的方法进行检测,结果没有检测出大肠杆菌。

3 讨 论

食品原料在加工、包装、运输和贮存过程中,由于温度、湿度、空气和光线等条件没有严格控制会使质量下降,产生安全隐患[25-26],霉变、虫蛀是最常见的变异现象,对于糖分、脂肪含量高的食品原料更容易发生腐烂变质、产生菌丝、微生物污染等现象[27-28]。本研究所用的枸杞子是2018年1月在不同产地收集,自然条件下贮存,并用构建的escV、stx2、hlyA质粒DNA标准品进行了大肠杆菌致病菌检测,结果在34 批样品中escV、stx2没有被检测出,有3 批枸杞样品中检测出hlyA,检出率为8.82%,选择被检出的3 批枸杞子样品,进行传统的微生物分离方法进行检测,并进行16S rRNA测序,结果没有检测出大肠杆菌。没有检出并不能代表枸杞子中不含有大肠杆菌,传统微生物检测方法中使用的增菌液没有针对性的对目的菌增菌,在大的微生物污染环境下,目标致病菌就很可能被抑制生长,大大降低了检出率[29]。PCR检测方法和传统的微生物分离检测技术相比不仅缩短了检测时间,而且检测结果的准确性也更高[30-31],本研究采用常规的PCR检测技术结合质粒构建成功构建了用于快速检测大肠杆菌的重组质粒DNA标准品,相对于传统微生物分离鉴定检出率有了很大的提高。姜睿娇等[32]通过双重荧光定量PCR方法和质粒构建技术结合成功构建了用于快速检测副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌的重组质粒标准品,并对临床28 份样品进行了检测,结果阳性检出率为53.57%,同时也采用了常规PCR技术和细菌分离鉴定同步进行检测,结果检出率分别为46.42%和28.57%。随着对微生物快速检测的要求越来越高,传统的细菌分离检测技术已经不能满足需求,细菌分离也较为困难,能分离出的细菌种类较少[33],并且耗时较长,大大降低了样品检测的准确性和效率。将PCR技术与多种技术相结合应用到食品中微生物的快速检测,不仅克服了传统检测方法的弊端,得到的检测结果准确度和灵敏度更高,检测效率也有了很大的提高。

本研究中构建的大肠杆菌中质粒标准品,经过菌落PCR、测序以及传代进行了验证,结果呈现100%,测序与GeneBank上已经公布的序列进行比对,比对率也均为100%,传代结果也显示出质粒标准品具有良好的稳定性。本研究使用的是一种即用型的阳性选择克隆载体pLB-simple Vector,pLB是在pLL3.7载体基础上的修改,添加了已知的防止表观遗传沉默的遗传元件,由于该载体含有一种致死基因,因此当克隆位点处插入外源片段时就会引起基因的失活[34],只有转化了重组质粒的细菌才能存活形成克隆菌落,可以保证在连接的过程中重组质粒的成功构建,基于pLB载体的这个优势,它在载体构建中得到了广泛的应用,本研究中制备的质粒标准品的A260 nm/A280 nm在1.8~2.0之间,纯度也较好。本研究将制备成功的质粒标准品进行了无菌冻干处理,制备成质量浓度在400 ng/μL左右的冻干粉,并进行了均匀性、稳定性研究,结果表明质粒标准品冻干粉均匀性、稳定性都较好,由于将质粒标准品进行了无菌冻干,也减少了冻干粉贮存过程中的污染机率,有研究将大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液进行了无菌冻干处理,并对其进行了均匀性和稳定性实验,结果表明其均匀性结果无显著性差异,保存过程中稳定性也较好[35-36]。

大肠杆菌作为食品安全微生物限量指标中的指示菌[37],不同的食品中对大肠杆菌的检出限量有不同的规定,当环境中检出含有大肠杆菌时,说明可能存在大肠杆菌污染,大肠杆菌本身作为一种正常肠道菌群,在一定的环境下可以使人致病[38]。当人们的日常饮食被大肠杆菌污染时,及时、准确地检测出来,不仅可以起到预防作用,减少疾病的爆发,也能做到溯源,有效地控制污染源的散播。

4 结 论

目前,我国对于食品安全未知风险发现能力较弱、风险识别与评估技术周期长、效率低、食品安全检测技术及相关标准缺乏[39-40]。无论与食品安全形势的实际需求,还是与国际食品安全基本标准相比,都存在较大差距。尤其是食品微生物定性和定量检验DNA参考物质体系不完整,极大限制了检验检测的水平。本研究以食源性微生物大肠杆菌为研究对象,构建大肠杆菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品,并对常用药食两用资源枸杞子进行检测,建立了一种可以应用的技术和质粒标准品。该质粒标准品能够为PCR快速检测食品和中药中大肠杆菌提供阳性对照,减小了方法的不确定性,保证检测结果的准确性,实现检测结果的可溯源性,为食品中大肠杆菌的快速检测提供技术参考。

相关链接:大肠杆菌枸杞子微生物致病菌副猪嗜血杆菌巴氏杆菌细菌金黄色葡萄球菌基因北纳生物

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